周楓葉，李 君，王嘉瑞，李啟山，喬 晶，楊 倩

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，呼和浩特 010110；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯穆浴⑷硇?、自身免疫性疾病，其病因?fù)雜、癥狀多樣、致殘率高[1-2]，治療的目的主要為改善癥狀、減少并發(fā)癥及提高生活質(zhì)量，臨床治療藥物主要包括非甾體類抗炎藥、抗風(fēng)濕藥及糖皮質(zhì)激素類，但上述藥物的長(zhǎng)期高劑量使用會(huì)導(dǎo)致胃腸不適、肝腎功能損害及股骨頭壞死、高血壓等[3]。

蒙藥阿如日-4味丸為蒙藥經(jīng)典驗(yàn)方，由制草烏、細(xì)辛、訶子和蓽茇組成，具有消“黏”，除“協(xié)日烏素”，祛風(fēng)、止痛和散寒等功效，由于處方中含有已證明有毒性的藥材，如制草烏和細(xì)辛，為評(píng)價(jià)其安全性，課題組對(duì)其進(jìn)行了急性毒性及亞急性毒性研究，以評(píng)價(jià)阿如日-4味丸的毒性、劑量與毒性反應(yīng)的關(guān)系及可能對(duì)靶器官的影響，從而為臨床安全用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 SysmexXT-1800i型全自動(dòng)血液分析儀，希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司；Sapphire600型全自動(dòng)生化分析儀，北京歐迪創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司；MC-4000plus型血凝分析儀，德國(guó)美創(chuàng)公司；DS-Y350型粉碎機(jī)，上海市頂帥工貿(mào)有限公司；BSA4202S型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2試藥 制草烏、訶子、蓽菝和細(xì)辛藥材，均購(gòu)自東營(yíng)百佳益中藥飲片有限公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(批號(hào)20160810)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；生理鹽水(批號(hào)D16070503)，山東華魯制藥有限公司；血液分析系統(tǒng)分析試劑，分別購(gòu)自希森美康生物科技有限公司和上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司；血清生化分析試劑，寧波美康生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物 KM小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22 g；SD大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量為180～220 g，均購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蒙)2015～0001，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)GLP中心屏障設(shè)施，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(蒙)2014～0003。溫度控制在20～26 ℃，日溫差≤3 ℃；相對(duì)濕度控制為40%～70%，每12 h明暗交替，每籠5只，飼喂Co60放射滅菌鼠全價(jià)顆粒飼料(北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.1.1分組及給藥 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將小鼠按照性別及體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組(5 g·L-1CMC-Na)和阿如日-4味丸組(12 g·kg-1)，每組20只，雌雄各半，給藥體積按照體質(zhì)量計(jì)(40 mL·kg-1)。

2.1.2觀察及檢測(cè)指標(biāo) 給藥后觀察小鼠可能出現(xiàn)的毒性癥狀及死亡情況，觀察指標(biāo)包括小鼠活動(dòng)狀態(tài)、被毛、口腔、眼鼻分泌物、糞便、尿液、耳和呼吸頻率等，后續(xù)每天上、下午分別觀察至第14天，于給藥后3、6、9、12、14 d固定時(shí)間測(cè)定體質(zhì)量，于給藥后3、6、9、12、15 d測(cè)定攝食量，對(duì)死亡小鼠及觀察期結(jié)束依然存活的小鼠進(jìn)行大體解剖觀察，如發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)異常可進(jìn)行病理學(xué)檢查[4-6]。

2.2亞急性毒性實(shí)驗(yàn)

2.2.1分組及給藥 將大鼠按照性別和體質(zhì)量隨機(jī)分為阿如日-4味丸低、中、高劑量組(2.7、5.4、10.8 g·kg-1，分別相當(dāng)于人臨床擬用劑量的15、30、60倍)和對(duì)照組(5 g·L-1CMC-Na)，每組20只，雌雄各半，給藥體積按照體質(zhì)量計(jì)20 mL·kg-1，連續(xù)28 d。

2.2.2觀察及檢測(cè)指標(biāo) 給藥期間每周測(cè)量體質(zhì)量及攝食量1次，并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥體積，給藥期間每天對(duì)大鼠進(jìn)行外觀、行為及活動(dòng)觀察并記錄，連續(xù)28 d，于末次給藥后禁食12 h，巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，進(jìn)行血液學(xué)和血液生化學(xué)檢測(cè)，血液學(xué)指標(biāo)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞容積(HCT)、平均紅細(xì)胞容積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白(MCH)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW-CV)、中性粒細(xì)胞比率(NEUT)、淋巴細(xì)胞百分比(LYMP)、單核細(xì)胞百分比(MONO)、嗜酸細(xì)胞絕對(duì)值(EO)、嗜堿細(xì)胞百分比(BASO)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)；血清生化指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(CRE)、血糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、三酰甘油(TG)、K+濃度、Na+濃度、Cl-濃度和Ca2+濃度；系統(tǒng)尸體解剖：對(duì)各臟器全面觀察；主要臟器質(zhì)量：心、肝、脾、腎、腦、腎上腺、甲狀腺和胸腺等；組織病理學(xué)檢查：腎上腺、主動(dòng)脈、腦、盲腸、結(jié)腸、子宮和子宮頸、十二指腸、附睪、食管、眼、心臟、回腸、空腸、腎臟、肝臟、肺臟(附主支氣管)、乳腺、卵巢和輸卵管、胰腺、垂體、前列腺、直腸、坐骨神經(jīng)、骨骼肌、皮膚、脾臟、胃、睪丸、胸腺(或胸腺區(qū)域)、甲狀腺、氣管及所有大體觀察到異常的組織，用100 g·L-1甲醛固定，以備組織病理學(xué)檢測(cè)[7-8]。

3 結(jié)果

3.1急性毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

3.1.1一般狀態(tài)觀察 給予阿如日-4味丸當(dāng)日上、下午觀察，未見(jiàn)小鼠死亡，同時(shí)，小鼠外觀、行為等均未出現(xiàn)異常；在隨后14 d對(duì)阿如日-4味丸組和對(duì)照組動(dòng)物進(jìn)行一般狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠活動(dòng)狀態(tài)、被毛、口腔、眼鼻分泌物、糞便、尿液、耳和呼吸頻率等均未出現(xiàn)異常；觀察期結(jié)束對(duì)小鼠進(jìn)行解剖觀察，外觀、皮下、胸腔、腹腔、心、肝、脾、肺、腎、腦和胃腸等臟器均未見(jiàn)明顯異常。

3.1.2阿如日-4味丸對(duì)小鼠體質(zhì)量及攝食量的影響 見(jiàn)表1、表2和表3。由表1、表2和表3可知，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸組各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量和攝食量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且各組小鼠體質(zhì)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

表1 阿如日-4味丸對(duì)雌性小鼠體質(zhì)量的影響

表2 阿如日-4味丸對(duì)雄性小鼠體質(zhì)量的影響

表3 阿如日-4味丸對(duì)小鼠攝食量的影響

3.2亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1一般狀態(tài)觀察 每日給藥后對(duì)大鼠進(jìn)行觀察，各組均未見(jiàn)大鼠死亡，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸低、中、高劑量組小鼠活動(dòng)狀態(tài)、行為、外觀、口腔、眼鼻分泌物、糞便和尿液等均未見(jiàn)異常。給藥結(jié)束后對(duì)大鼠進(jìn)行解剖觀察，外觀、皮下、胸腔、腹腔、心、肝、脾、肺、腎、腦和胃腸等臟器均未檢出肉眼可見(jiàn)異常。

3.2.2阿如日-4味丸對(duì)大鼠體質(zhì)量及攝食量的影響 見(jiàn)表4、表5和表6。由表4、表5和表6可知，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸低、中、高劑量組同一測(cè)量時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量和攝食量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 阿如日-4味丸對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量的影響

表5 阿如日-4味丸對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量的影響

表6 阿如日-4味丸對(duì)大鼠攝食量的影響

3.2.3阿如日-4味丸對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 見(jiàn)表7和表8。由表7和表8可知，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸中劑量組雄性大鼠血清ALT和HDL升高、CRE降低(P<0.05)；阿如日-4味丸高劑量組雄性大鼠血清GLU降低(P<0.01)；阿如日-4味丸低劑量組雄性大鼠血清生化指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸高劑量組雌性大鼠的LDL降低(P<0.05)，其他各組雌性大鼠指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表7 雄性大鼠血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表8 雌性大鼠血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

注：與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01。

3.2.4阿如日-4味丸對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 見(jiàn)表9和表10。由表9和表10可知，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸低劑量組雄性大鼠的MCH、MCHC均升高，APTT降低(P<0.05)；阿如日-4味丸中劑量組雄性大鼠的RBC降低(P<0.05)，MCV、MCH均升高(P<0.05)；阿如日-4味丸高劑量組雄性大鼠的EO升高(P<0.01)。與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸低劑量組雌性大鼠的RBC、HGB、APTT均降低(P<0.05)，NEUT升高(P<0.05)；阿如日-4味丸中劑量組雌性大鼠的RDW-CV升高(P<0.05)，APTT降低(P<0.05)；阿如日-4味丸高劑量組雌性大鼠的RDW-SD升高(P<0.01)，HGB降低(P<0.01)。

表9 雄性大鼠血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表10 雌性大鼠血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

3.2.5阿如日-4味丸對(duì)大鼠臟器濕質(zhì)量的影響結(jié)果 見(jiàn)表11和表12。由表11可知，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸低劑量組雄性大鼠心、左腎(P<0.05)和腎上腺(P<0.01)濕質(zhì)量降低；阿如日-4味丸高劑量組雄性大鼠左腎濕質(zhì)量降低(P<0.05)。由表12可知，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸中劑量組雌性大鼠肝濕質(zhì)量升高(P<0.05)。

表11 雄性大鼠臟器質(zhì)量稱量結(jié)果

表12 雌性大鼠臟器質(zhì)量稱量結(jié)果

4 討論

阿如日-4味丸處方中制草烏所含生物堿類既是有效成分也是毒性成分[9]，臨床使用不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，如惡心、嘔吐，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)心率緩慢或節(jié)律紊亂，血壓下降以致休克或死亡等癥狀[10]；細(xì)辛中主要化學(xué)成分有馬兜鈴酸、細(xì)辛脂素和揮發(fā)油等[11]，長(zhǎng)期使用細(xì)辛可致呼吸毒性、肝腎毒性和遺傳毒性等[12-13]，對(duì)其進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)具有重要意義。

阿如日-4味丸的成人臨床服用劑量為每次2 g，每日1次，以70 kg成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量計(jì)算，臨床擬用劑量為0.029 g·kg-1，急性毒性研究中，40 mL·kg-1為小鼠的最大給藥劑量、300 mg·mL-1為最大給藥質(zhì)量濃度，約為人臨床擬用劑量的414倍。根據(jù)重復(fù)給藥相關(guān)指導(dǎo)原則，亞急性毒性研究劑量設(shè)計(jì)時(shí)，應(yīng)保證暴露量不低于臨床暴露量的50倍，為充分暴露毒性，設(shè)置阿如日-4味丸高、中、低劑量組(10.8、5.4、2.7 g·kg-1，約為人臨床擬用劑量的60、30、15倍)。

這項(xiàng)研究用KM小鼠和SD大鼠進(jìn)行了阿如日-4味丸急性和亞急性毒性實(shí)驗(yàn)。在急性毒性研究中，以最大給藥量、最大給藥體積給予阿如日-4味丸混懸液后，與對(duì)照組比較，阿如日-4味丸組小鼠行為、外觀及活動(dòng)狀態(tài)等均未見(jiàn)異常，且未出現(xiàn)小鼠死亡，阿如日-4味丸組小鼠的體質(zhì)量、攝食量與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；觀察期結(jié)束解剖小鼠，心、肝、脾、肺、腎、腦等主要臟器均未見(jiàn)明顯異常，給予阿如日-4味丸的最大耐受劑量高于12 g·kg-1，約為臨床擬用劑量的414倍，提示阿如日-4味丸臨床應(yīng)用安全可靠。

在28 d亞急性毒性研究中，各組大鼠連續(xù)給予阿如日-4味丸后，大鼠的一般狀態(tài)觀察未見(jiàn)異常，與對(duì)照組比較，各組大鼠體質(zhì)量、攝食量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示阿如日-4味丸對(duì)大鼠體質(zhì)量及攝食量無(wú)影響；雖然血液學(xué)指標(biāo)(MCH、MCHC、APTT、RBC、RDW-CV、RDW-SD等)、血清生化指標(biāo)(ALT、HDL、CRE、GLU、LDL)及臟器濕質(zhì)量(心、左腎、腎上腺及肝)部分個(gè)別指標(biāo)出現(xiàn)異常，但變化無(wú)量效關(guān)系且絕對(duì)值變化較小，因此認(rèn)為無(wú)毒理學(xué)意義，出現(xiàn)上述情況的原因可能是由采血操作或儀器引起的誤差。

綜上所述，小鼠給予12 g·kg-1阿如日-4味丸是安全的，未引起明顯的毒性或不良反應(yīng)；連續(xù)28 d給予10.8 g·kg-1阿如日-4味丸對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)、血液學(xué)指標(biāo)、體質(zhì)量及攝食量等各項(xiàng)指標(biāo)均未產(chǎn)生明顯影響，提示阿如日-4味丸臨床用藥安全可靠。