熊亞立，陳 誠，胡光明，孫占虎，郭小剛

(重慶市黔江中心醫(yī)院普外科，重慶 409000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種以腹瀉、腹痛和血便等為主要臨床癥狀、病因尚不十分清楚的結(jié)直腸慢性非特異性炎癥性疾病[1]。目前有研究認(rèn)為，UC是由于腸道菌群及其代謝產(chǎn)物作用于易感性宿主，導(dǎo)致腸道過度激活的異常免疫反應(yīng)造成[2]。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)過程中的重要參與者[3]，在UC中巨噬細(xì)胞受腸道微環(huán)境的影響而激活，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，抵抗病原體入侵[4]。但由于腸道長期異常的炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞在抵抗病原的同時也造成了腸道黏膜的損傷，加劇了UC的病程[5]。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2/M1失衡，將有助于緩解UC。

小檗堿是抑制炎癥反應(yīng)的經(jīng)典單體化合物[6]，具有清熱解毒、抗菌等多種功效，臨床主治腸炎[7]。本文探究小檗堿對結(jié)腸巨噬細(xì)胞的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用小檗堿治療UC提供更多理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 MultiskanTMFC型酶標(biāo)儀，美國賽默飛世爾科技公司；StepOnePlusTMSystem PCR儀，美國應(yīng)用生物公司；5804R型低溫離心機(jī)，德國艾本德公司；Cytoflex型流式細(xì)胞儀，美國貝克曼庫爾特公司；RM2125RTS型切片機(jī)、DM-500型顯微鏡，均購自德國萊卡公司。

1.2試藥 小檗堿，購自中國食品藥品檢定研究院；葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子質(zhì)量為40 000)、RNase I，均購自Sigma公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green qPCR Mix，均購自TaKaRa公司；Collagenase I、牛血清白蛋白(BSA)，均購自Gibco公司；抗小鼠FITC-CD11b、Pe-Cy7-F4/80、PE-CD86、APC-CD206抗體，均購自Bio Legend公司；促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和抗炎因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)、腫瘤生長因子-β(TGF-β) Elisa試劑盒，均購于北京達(dá)科為公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠，雄性，6周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0008。飼養(yǎng)溫度：25 ℃，相對濕度：50%。

2 方法

2.1造模、分組與治療 將30只小鼠隨機(jī)均分成對照組、模型組和小檗堿組，每組10只。對照組：正常飲水和灌胃等體積生理鹽水；模型組：飲用含50 g·L-1DSS的水和灌胃等體積生理鹽水；小檗堿組：飲用含50 g·L-1DSS的水和灌胃小檗堿(100 mg·kg-1，每日1次)。連續(xù)給藥9 d。

2.2小鼠UC癥狀評測 每日按時稱定小鼠體質(zhì)量，記錄糞便性狀、便血情況。給藥處理結(jié)束后，引頸處死小鼠，取出結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定，經(jīng)脫水后用石蠟包埋，切片機(jī)切片，HE染色后觀察，進(jìn)行病理組織學(xué)指數(shù)(HI)評分。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[8]，HI評分標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)炎癥程度：0=無；1=輕度；2=中度；3=重度；(2)病變深度：0=無；1=黏膜；2=黏膜和黏膜下層；3=全層；(3)病變范圍：0=無；1=0%～30%；2=31%～60%；3=大于60%。

2.3結(jié)腸組織中細(xì)胞因子檢測 將小鼠結(jié)腸組織取出，用生理鹽水清洗干凈。加入2倍生理鹽水，在勻漿器中將結(jié)腸組織充分勻漿。在4 ℃條件下以50 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于細(xì)胞因子檢測。按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行檢測操作，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各樣本中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β水平。

2.4結(jié)腸組織中p65、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg1)的mRNA表達(dá)檢測 將小鼠結(jié)腸組織取出，用生理鹽水清洗后，再用Trizol法提取細(xì)胞總mRNA。分別取1 μg mRNA用TaKaRa反錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水(ddH2O) 6.8 μL，引物序列見表1。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，反應(yīng)40個循環(huán)。采用2-△△Ct法分析目的基因p50、p65、Arg1和iNOS的mRNA表達(dá)。

表1 引物序列

2.5結(jié)腸巨噬細(xì)胞極性檢測 將小鼠結(jié)腸組織取出，用生理鹽水漂洗干凈，剪成小塊，置于含1 mg·mL-1Collagenase I和0.5 μg·mL-1RNase I的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃消化1 h。經(jīng)40 μm細(xì)胞過濾器過濾后，用PBS重懸并清洗2次，得到小鼠結(jié)腸組織單細(xì)胞懸液。使用20 g·L-1BSA/PBS溶液在4 ℃環(huán)境下對細(xì)胞封閉30 min后，取1×106個細(xì)胞(100 μL)，按照說明書分別加入適量抗小鼠FITC-CD11b、Pe-Cy7-F4/80、PE-CD86和APC-CD206抗體，避光孵育30 min，4 ℃離心5 min，去上清液，PBS重懸后上機(jī)檢測M1和M2型細(xì)胞比例，其中CD11b+F4/80+CD86+陽性細(xì)胞為M1型巨噬細(xì)胞、CD11b+F4/80+CD206+陽性細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞。

3 結(jié)果

3.1小檗堿對UC小鼠癥狀的影響 見表2。由表2可知，對照組小鼠體質(zhì)量隨實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行逐漸增加，且在整個實(shí)驗(yàn)過程中其大便、飲食及活動均正常。與對照組小鼠相比，模型組小鼠的體質(zhì)量逐漸減輕，出現(xiàn)明顯腹瀉、黏液膿血便，小鼠大多數(shù)蜷縮，活動程度下降。但是經(jīng)小檗堿灌胃治療后，UC小鼠體質(zhì)量下降得到緩解(P<0.05)，腹瀉、黏液膿血便情況好轉(zhuǎn)，活動度也略有增加。給藥治療結(jié)束后，將各組小鼠處死，觀察小鼠結(jié)腸部分。與對照組相比，模型組小鼠的結(jié)腸出現(xiàn)多處不同程度的潰瘍甚至糜爛，而經(jīng)小檗堿灌胃治療后，UC小鼠結(jié)腸潰瘍部位明顯減少，且程度明顯減輕。取部分結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色，模型組小鼠的HI評分顯著升高；與模型組比較，小檗堿組小鼠結(jié)腸黏膜病理損傷減輕，HI評分明顯降低(P<0.05)，見表3。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度為50 g·L-1的DSS處理會誘發(fā)小鼠嚴(yán)重的UC，而采用小檗堿進(jìn)行灌胃治療后，能明顯緩解UC小鼠的癥狀。

表2 各組小鼠體質(zhì)量的變化

表3 各組小鼠腸道病理HI評分

3.2小檗堿對UC小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的影響 將治療結(jié)束后的小鼠的結(jié)腸組織取出，勻漿后采用Elisa法檢測炎癥因子的變化情況，見表4。由表4可知，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)，而對于結(jié)腸炎具有緩解作用的抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β水平則顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，小檗堿組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6水平顯著下降(P<0.05)，而IL-10和TGF-β水平升高(P<0.05)。

表4 各組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β水平

3.3小檗堿調(diào)控UC小鼠結(jié)腸巨噬細(xì)胞極性變化 見表5和圖1。由表5和圖1可知，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織iNOS的mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，Arg1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組比較，小檗堿組小鼠結(jié)腸組織中iNOS mRNA表達(dá)下降，Arg1 mRNA表達(dá)上調(diào)。Western Blot結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中iNOS蛋白表達(dá)上升，Arg1蛋白表達(dá)降低。與模型組比較，小檗堿組小鼠結(jié)腸組織中iNOS 蛋白表達(dá)下降，Arg1的蛋白表達(dá)上調(diào)。流式檢測數(shù)據(jù)也表明了類似的結(jié)果，見表6和圖2。由表6和圖2可知，與對照組比較，模型組中M1巨噬細(xì)胞比例明顯升高，M2巨噬細(xì)胞比例顯著下降。而在經(jīng)小檗堿治療后，UC小鼠結(jié)腸組織中M1巨噬細(xì)胞比例降低，而M2巨噬細(xì)胞比例升高，M2/M1比例顯著提高(P<0.05)。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織中不同極性巨噬細(xì)胞比例

表5 各組小鼠結(jié)腸組織Arg1、iNOS、p65、p50 mRNA表達(dá)

表6 各組小鼠結(jié)腸組織中不同極性巨噬細(xì)胞比例

3.4小檗堿抑制NF-κB通路促進(jìn)結(jié)腸巨噬細(xì)胞M2極化 為了探究小檗堿是如何影響結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞的極性變化的，檢測了結(jié)腸組織中NF-κB的2個亞基p65和p50的mRNA表達(dá)情況。由表5可知，與對照組相比，模型組的p65和p50 mRNA表達(dá)升高，而經(jīng)小檗堿處理后，升高的p65和p50 mRNA表達(dá)受到了顯著抑制(P<0.05)。接著使用Western Blot法進(jìn)一步檢測p65的蛋白表達(dá)變化情況，結(jié)果見圖1，模型組升高的P-p65在小檗堿治療后蛋白表達(dá)明顯下降。

圖1 各組小鼠結(jié)腸組織Western Blot結(jié)果

4 討論

UC是一種以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床癥狀的復(fù)發(fā)性慢性炎癥性腸道疾病[2，9]，關(guān)于UC的生理病理學(xué)和相關(guān)的分子機(jī)制研究尚未十分明確，導(dǎo)致其成為公認(rèn)的難治性疾病之一。流行病學(xué)調(diào)查表明，我國結(jié)腸炎和結(jié)腸炎誘發(fā)的相關(guān)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。研究表明，腸道黏膜免疫系統(tǒng)的過度激活導(dǎo)致了UC的反復(fù)發(fā)作和進(jìn)一步加重[10-11]。因此，調(diào)控腸道組織的炎癥反應(yīng)有助于緩解UC。

腸道中存在大量的巨噬細(xì)胞，他們既是固有免疫的重要組成部分，又是炎癥反應(yīng)的參與者，在維持腸道黏膜層微生物穩(wěn)態(tài)、炎性微環(huán)境中起著關(guān)鍵作用[12]。巨噬細(xì)胞是由血液中的單核細(xì)胞招募、分化而來，可根據(jù)其所處生理病理環(huán)境的變化而調(diào)整自身的生理功能，表現(xiàn)出非常強(qiáng)的可塑性。根據(jù)活化狀態(tài)和生理功能，巨噬細(xì)胞主要可分成M1型和M2型2種功能截然相反的類型。M1型巨噬細(xì)胞，也稱為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞[13]，由脂多糖(LPS)、免疫干擾素-γ(IFN-γ)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等因子激活，可產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)的吞噬病原體和殺傷微生物的能力，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮主要作用，也會由于過度激活而造成機(jī)體損傷，引發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病(IBD)等多種自身免疫性疾病[14]。M2型巨噬細(xì)胞又稱為替代性活化巨噬細(xì)胞，由白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-10、TGF-β、GM-CSF等激活，可分泌多種抗炎細(xì)胞因子，在組織修復(fù)與重塑、血管新生和腫瘤形成等過程中發(fā)揮重要作用[15]。機(jī)體正常生理情況下，M2/M1巨噬細(xì)胞比例維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，可調(diào)控機(jī)體正常的炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)DSS誘導(dǎo)后小鼠結(jié)腸組織中M1巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+CD86+)比例明顯升高，結(jié)腸組織中TNF-α和IL-6的水平也顯著增加，小鼠也相應(yīng)出現(xiàn)明顯的UC癥狀，說明腸道巨噬細(xì)胞的M1過度活化引起的持續(xù)炎癥反應(yīng)是包括UC在內(nèi)的炎癥腸道疾病發(fā)病和加重的重要原因[16]。因此，促進(jìn)腸道巨噬細(xì)胞由M1型向M2型極化，將有助于減輕腸道組織的炎癥反應(yīng)，緩解UC的發(fā)展。

NF-κB信號通路是巨噬細(xì)胞M1型極化的重要調(diào)控通路[17]。巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS等刺激，導(dǎo)致胞內(nèi)形成核因子抑制κ激酶α(IKKα)、核因子抑制κ激酶β(IKKβ)、核因子抑制κ激酶γ(IKKγ)構(gòu)成的核因子抑制κ激酶(IKK)聚合物。在該聚合物的作用下，使核因子κB抑制蛋白(IκB)磷酸化而被蛋白酶體降解，解除對NF-κB的抑制作用。由p50亞單位和p65亞單位組成的NF-κB異源二聚體，由此可進(jìn)入細(xì)胞核，介導(dǎo)炎癥相關(guān)基因如TNF-α、IL-6、IL-1β等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究表明，通過抑制NF-κB的活性可有效改善實(shí)驗(yàn)性UC[18]。因此，尋找安全、有效的藥物抑制NF-κB活性從而治療UC是亟需解決的難題之一。

小檗堿又名黃連素，是從中藥黃連及黃柏等多種清熱解毒中藥材中提取出的異喹啉類生物堿，具有清熱、去火、解毒等多種療效，在臨床上已應(yīng)用多年[7]。近年來對小檗堿的研究發(fā)現(xiàn)，其具有明顯的抗炎效果，對治療UC、糖尿病、動脈粥樣硬化等炎癥紊亂相關(guān)疾病具有較好的效果[19]。研究表明，小檗堿可抑制促炎的輔導(dǎo)性T細(xì)胞(Th17)的細(xì)胞分化，促進(jìn)抗炎調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的細(xì)胞分化和白細(xì)胞介素35 (IL-35)的表達(dá)，減輕腸道黏膜炎癥，保護(hù)結(jié)腸黏膜[20]。體外研究也表明，小檗堿能夠抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞系RAW264.7由M1型轉(zhuǎn)化到M2型。但小檗堿在體內(nèi)是否能引起巨噬細(xì)胞的M2極化則有待進(jìn)一步研究。

本文通過給予UC小鼠小檗堿灌胃治療，能夠顯著減輕UC的癥狀，抑制結(jié)腸組織促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10和TGF-β的表達(dá)。進(jìn)一步的研究顯示，小檗堿能夠下調(diào)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸iNOS的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，上調(diào)Arg1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)，促進(jìn)M1型轉(zhuǎn)變成M2型，提高M(jìn)2/M1比例。小檗堿可能是通過抑制NF-κB信號通路實(shí)現(xiàn)結(jié)腸巨噬細(xì)胞M1到M2型的逆極化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗堿能夠有效改善腸道炎癥反應(yīng)，保護(hù)結(jié)腸黏液層，緩解UC，為闡明小檗堿臨床治療UC的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。