馬彥娟，牛麗丹，張建新，吳 畏，孔令宇，蔡君艷，石金河

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院急診科，衛(wèi)輝 453100)

急性胰腺炎(AP)是胰腺的突發(fā)性炎癥過程，是由多種病因導致胰腺內胰酶被激活從而引發(fā)胰腺組織自身的炎癥反應[1-2]，其發(fā)病機制復雜，涉及多種因素，包括活化的胰酶、細胞因子和趨化因子等[3]。轉化生長因子β1(TGF-β1)參與調節(jié)細胞增殖、分化、凋亡和免疫反應等多種生物學過程[4]。研究顯示，AP患者及AP模型動物的TGF-β1信號通路表達均上調[5-7]。動物實驗顯示，在AP模型大鼠血清中miRNA-216a mRNA的表達顯著升高[8-9]。

課題組前期研究結果顯示，地塞米松(DEX)對AP模型胰腺中的Notch信號通路有一定程度的影響[10]，對其他信號通路，如TGF-β1/Smad/細胞外信號調節(jié)蛋白激酶(ERK)信號通路及miRNA-216a mRNA的影響還未見報道。本研究利用蛙皮素建立小鼠AP模型，進一步探索DEX對胰腺腺泡細胞保護的作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 全自動生化檢測儀(日本株式會社日立制作所)；LightCycler LC480 Real-Time PCR system(瑞士羅氏公司)；Bio-Rad SDS-PAGE型電泳分離儀(美國伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)；ODYSSEY型雙色紅外激光成像系統(美國LI-COR Biosciences公司)。

1.2試藥 兔抗TGF-β1抗體(貨號：ab92486)，兔抗P-Smad3抗體(貨號：ab40854)，Smad7抗體(貨號：ab216428)，兔抗磷酸化細胞外信號調節(jié)蛋白激酶1/細胞外信號調節(jié)蛋白激酶2(P-ERK/ERK2)抗體(貨號：ab17942)，均購自美國Abcam公司；兔抗GAPDH抗體，美國Sigma公司；RT-qPCR試劑盒，均購自北京全式金生物技術有限公司。淀粉酶(AMY)與脂肪酶(LPS)檢測試劑盒，購于南京建成生物研究所；DEX(批號20140629)，天津金耀藥業(yè)有限公司;蛙皮素(批號60321ES03)，上海翊圣生物科技有限公司。

1.3動物 清潔級健康雄性C57BL/6J小鼠60只，購于新鄉(xiāng)醫(yī)學院實驗動物中心，體質量為25～30 g，實驗過程經實驗動物福利委員會許可，動物使用許可證號：SYXK(豫) 2011-0001。

2 方法

2.1造模 將小鼠隨機分為對照組(10只)、AP組(25只)和DEX組(25只)。造模過程參照楊飛云等[11]實驗方法，將蛙皮素溶于生理鹽水中制成質量濃度為10 μg·mL-1的溶液，AP組小鼠用蛙皮素腹腔注射，劑量為50 μg·kg-1，連續(xù)注射3次，每次間隔2 h；DEX組在每次注射蛙皮素后腹腔注射質量濃度為5 μg·mL-1的DEX，1 mL·kg-1；對照組連續(xù)3次注射生理鹽水。所有小鼠均在最后1次注射后2 h處死，采集各組小鼠的血液及胰腺組織。

2.2血清中AMY和LPS的水平測定 將小鼠血液以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書操作，通過速率法對AMY和LPS的水平進行檢測。

2.3血清促炎因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6 (IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和TGF-β1水平測定 將小鼠血液以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用Elisa法測定各組胰腺組織和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的水平。

2.4胰腺組織中miRNA-216a mRNA表達的測定 利用RT-qPCR法檢測胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達。將各組小鼠的胰腺組織分別研成粉末狀后，置于1.5 mL Ep管中，加入適量的Trizol 試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒的說明書將RNA逆轉錄成cDNA。引物序列由上海生工設計并合成(miRNA-216a上游引物5′-TAATCTCAGCTGGCAACTGTGA-3′，下游引物5′-TCACAGTTGCCAGCTGAGATTA-3′；內參GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物5′-TGGTCCAGGGTTTCTACTCC-3′)。以cDNA為模板進行擴增，RT-qPCR反應條件:預變性94 ℃ 30 s，變性94 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。

2.5胰腺組織中TGF-β1、Smad7、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達 利用Western Blot 法檢測各組小鼠胰腺組織中TGF-β1、Smad7、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達情況。將各組小鼠胰腺組織分別研成粉末狀后移至1.5 mL Ep管中，加入適量的RIPA裂解液，離心，取上清液，利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。利用Bio-Rad SDS-PAGE電泳分離蛋白后移至NC膜，分別加Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Ⅰ抗稀釋使用濃度分別為TGF-β1抗體(1∶1 000)、Smad7抗體(1∶1 000)、P-Smad3抗體(1∶500)、P-ERK1/ERK2抗體(1∶500)、GAPDH抗體(1∶10 000)，加熒光Ⅱ抗室溫孵育2 h后，利用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統曝光，采集圖像分析灰度值。

3 結果

3.1血清中AMY與LPS水平變化 見表1。由表1可知，與對照組比較，AP組血清中AMY與LPS水平均顯著升高(P<0.01)；與AP組比較，DEX組血清中二者的水平均顯著降低(P<0.05)。

表1 3組小鼠血清中AMY和LPS水平的比較

3.2小鼠胰腺組織及血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平 結果見表2和表3。由表2和表3可知，與對照組比較，AP組小鼠胰腺組織與血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平均顯著升高(P<0.01)；與AP組比較，DEX組小鼠胰腺組織與血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平均顯著降低(P<0.05)。

表2 3組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平比較

表3 3組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β和TGF-β1水平比較

3.3小鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達結果 與對照組比較，AP組小鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達顯著升高(2.787±0.422)，差異有統計學意義(P<0.001)；與AP組比較，DEX組小鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達顯著降低(2.315±0.239)，差異有統計學意義(P<0.05)。

3.4各組小鼠胰腺組織中TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2的蛋白表達結果 見圖1和表4。

表4 TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2蛋白在小鼠胰腺組織中的表達

由圖1和表4可知，與對照組比較，AP組小鼠胰腺組織中TGF-β1、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，而Smad7的蛋白表達顯著降低(P<0.001)；與AP組比較，DEX組小鼠胰腺組織中TGF-β1、P-Smad3和P-ERK1/ERK2的蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而Smad7的蛋白表達顯著升高(P<0.01)。

圖1 TGF-β1、P-Smad3、Smad7和P-ERK1/ERK2蛋白在胰腺組織中的表達

4 討論

AP的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，涉及眾多因素，包括活化的胰酶、細胞因子和趨化因子等[3]。轉化生長因子β(TGF-β)信號通路參與多種生理病理過程，在組織細胞的生長、發(fā)育、增殖和分化中起關鍵作用，對免疫功能、炎癥反應等具有重要的調節(jié)作用。TGF-β有3種亞型，即TGF-β1、轉化生長因子β2(TGF-β2)和轉化生長因子β3(TGF-β3)。研究顯示，在AP模型中，TGF-β1的表達升高，其參與AP的病理過程，抑制其可減輕AP的嚴重程度[6，12-14]。激活的TGF-β1，可被下游的Smad2和Smad3蛋白識別，將信號傳遞給細胞信號轉導分子Smad4，最終上調Smad7的轉錄活性[15]。李永濤等[16]研究顯示，AP患者胰腺組織中TGF-β1、TNF-α和IL-6等水平均顯著升高，參與AP的病理過程。

miRNA作為一種非編碼的RNA，在免疫應答和炎癥反應過程中，其可通過調控靶基因的表達而發(fā)揮重要的作用[17]。在AP模型大鼠血漿中miRNA-216a mRNA的表達顯著升高，參與AP的病理過程，可作為AP診斷的潛在生物標志[9，18-19]。

DEX是一種皮質類固醇，具有抗炎和改善微循環(huán)的作用，臨床上應用其治療AP[20-21]。前期研究結果顯示，DEX對AP模型動物胰腺中的Notch信號通路及NK-κB信號通路均有一定程度的影響[10-11]，它對其他信號通路，如TGF-β1/Smad/ERK信號通路及miRNA-216a mRNA表達的影響尚未見報道。

本研究結果顯示，AP組大鼠胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達顯著高于對照組，這與以往研究結果一致，與AP組比較，使用DEX治療后，動物胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達顯著降低，說明DEX可降低AP動物胰腺組織中miRNA-216a mRNA的表達。

本文研究了AP中DEX對TGF-β信號通路的影響，初步闡明了DEX治療AP的作用機制。使用DEX治療后，TGF-β信號通路中TGF-β1、P-Smad3及P-ERK1/ERK2的蛋白表達顯著降低，而Smad7的蛋白表達顯著升高。同時，使用DEX治療后，動物胰腺組織與血清中的TNF-α、IL-6及IL-1β、TGF-β1的水平均顯著降低，結果提示，AP發(fā)生時，DEX可通過抑制TGF-β1的水平，抑制Smad3蛋白的磷酸化，進而抑制ERK1/ERK2蛋白的磷酸化，同時促進Smad7的表達，從而抑制TGF-β1/Smad/ERK信號通路的激活；AP過程中，參與炎癥反應的炎癥細胞因子主要有IL-1β、TNF-α、IL-6與TGF-β1等，本研究中DEX通過抑制TGF-β1/Smad/ERK信號通路的激活，減少炎癥因子的合成與釋放，減輕對胰腺腺泡細胞的損傷。

Zhang J等[6]研究表明，TGF-β可調節(jié)miRNA-216a，抑制TGF-β后可抑制miRNA-216a mRNA的表達，DEX是否可通過抑制TGF-β信號通路而抑制miRNA-216a，有待進一步研究，下一步將通過細胞實驗研究DEX的作用機制，為臨床治療AP提供參考。