李子鋒 付遠芝 周曉靜 扶曉蘭 楊路煥 王 楚 常彩云

(1. 三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 中醫(yī)科， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 胸心外科， 湖北 宜昌 443003； 3. 三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 兒科， 湖北 宜昌 443003； 4. 三峽大學 第一臨床醫(yī)學院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 急診科， 湖北 宜昌 443003； 5. 中國康復研究中心 北京博愛醫(yī)院 脊柱骨髓神經(jīng)功能重建科， 北京 100068)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫介導，以慢性免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的可復發(fā)疾病。主要累及皮膚黏膜、骨骼肌肉、腎和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時還可以影響肺、心臟、血液、消化等多個器官和系統(tǒng)，具有不同的臨床表現(xiàn)和預后。如果不及時治療，甚至能夠引起腎功能衰竭等致死性損害，嚴重危害人類健康[1,2]。SLE的全球發(fā)病率約為40～70/10萬，而我國有估計超過100萬SLE患者。目前臨床對于SLE的治療仍然以激素、免疫抑制劑和非甾體抗炎藥為主，臨床療效有限[3]。

SLE的發(fā)病機制尚不清楚，有研究認為生活環(huán)境、激素水平、遺傳、表觀遺傳異常是該病的病因[4-6]。雖然遺傳機制在SLE發(fā)病中起重要作用，但是僅遺傳機制不能解釋為何同卵雙生子一個發(fā)病而另一個不發(fā)病[7]，且許多為散發(fā)病例，沒有家族史。近年來大量的研究表明，表觀遺傳機制在SLE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[7-10]。表觀遺傳修飾是可遺傳的、可逆的、不改變DNA本身序列的基因修飾方式，主要包括DNA甲基化(DNA methylation，DNMT)、組蛋白修飾和非編碼RNA等。表觀遺傳修飾通過參與調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達，影響免疫細胞分化發(fā)育、免疫應答相關(guān)分子活化及細胞因子分泌表達等，進而參與免疫調(diào)控。許多受表觀基因調(diào)控的信號分子和受體，在SLE等多種自身免疫性疾病及炎癥過程中出現(xiàn)失調(diào)[11,12]。

DNA甲基化為DNA化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。DNA甲基化由三種不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化，分別是DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。DNA甲基化的維持是由DNMT1介導的，而從頭甲基化則由DNMT3A和DNMT3B主導[13]。

既往研究顯示，DNMT1表達水平與SLE疾病活動指數(shù)(SLE disease activity index，SLEDAI)有負相關(guān)性[14]或無相關(guān)性[15]。然而，近年來Mariusz等[16]研究表明DNMT1表達水平與SLEDAI成正相關(guān)。為了綜合評價DNMT1表達水平與SLEDAI之間相關(guān)性，本研究擬進行系統(tǒng)評價和meta分析。

1 資料與方法

1.1 計劃書

研究方案在PROSPERO注冊，PROSPERO編號：CRD42020177287。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 研究類型

納入研究類型不做限制。

1.2.2 研究對象

SLE符合《1982年美國風濕病學會修訂的SLE標準》[17]或《1997年美國風濕病協(xié)會修訂的SLE診斷標準》[18]。

1.2.3 結(jié)局指標

采用SLE疾病活動指數(shù)[19]進行測量，并計算DNMT1與SLEDAI的相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 排除標準

①合并高血壓、糖尿病等其他基礎疾病患者；②不包含所研究的結(jié)局指標；③無法提取數(shù)據(jù)或未找到全文；④重復發(fā)表；⑤數(shù)據(jù)錯誤。

1.3 檢索策略

本研究使用了三步檢索策略。第1步：對Pubmed和知網(wǎng)進行了初步檢索，分析標題、摘要及關(guān)鍵詞，然后咨詢風濕科醫(yī)師確定相關(guān)術(shù)語；第2步：由兩人分別進行檢索；第3步：對所納入的文獻及其參考文獻進行檢索和審查，用來尋找其他符合納入標準的文獻。

英文數(shù)據(jù)庫：Pubmed、Web of Science、Cochrane Library、Embase；中文數(shù)據(jù)庫：知網(wǎng)、萬方、維普。檢索時間：數(shù)據(jù)庫建立至2020年4月3日。文獻種類：期刊論文、學位論文、會議論文、灰色文獻。

以Pubmed為例具體檢索策略如下：

#1：Search (((((Search “l(fā)upus erythematosus, systemic” [Mesh]) OR systemic lupus erythematosus) OR lupus erythematosus disseminatus) OR libman-sacks disease) OR disease, libman-sacks) OR libman sacks disease

#2：Search ((SLE disease activity index) OR disease activity index) OR SLEDAI

#3：Search (((Search “DNMT1 protein, human [Supplementary Concept]”[Mesh]) OR CXXC9 protein, human) OR DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 1, human) OR DNA methyltransferase 1, human

#4：Search (Search “Site-Specific DNA-Methyltransferase (Cytosine-N(4)-Specific)” [Mesh]) OR N (4)-Cytosine-Specific DNA Methylase

#5：Search (((((((((Search “Site-Specific DNA-methyltransferase(adenine-specific)” [Mesh]) OR DNA modification methylases adenine specific) OR DNA modification methylases (adenine-specific)) OR modification methylases (adenine-specific)) OR site-specific methyltransferases (adenine specific)) OR site-specific methyltransferases (adenine-specific)) OR DNA-adenine methylases) OR DNA adenine methylases) OR methylases, DNA-adenine) OR modification methylases (adenine specific)

#6：Search (((((((Search “DNA methyltransferase 3A [Supplementary Concept]”[Mesh]) OR DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A, human) OR DNMT3A protein, rat) OR Dnmt3a2 protein, human) OR DNMT3A protein, human) OR DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 alpha protein, human) OR Dnmt3a protein, mouse) OR DNA methyltransferase 3A protein, mouse

#7：Search ((((((((((Search “DNA methyltransferase 3B [Supplementary Concept]” [Mesh]) OR DNMT3B protein, human) OR hDNA methyltransferase 3b) OR DNA (cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta protein, human) OR DNMT3B protein, rat) OR DNMT3B3DELTA5 protein, human) OR DNMT3B delta5 isoform, mouse) OR DNMT3B4 protein, human) OR DNA (cytosine-5-) methyltransferase 3B1, human) OR Dnmt3b protein, mouse) OR DNA methyltransferase 3B protein, mouse

#8：Search ((((((((((((DNA methyltransferase) OR DNA methyltransferase 1) OR DNA methyltransferase 2) OR DNA methyltransferase 3A) OR DNA methyltransferase 3B) OR DNA methyltransferase 3L) OR DNMT) OR DNMTs) OR DNMT1) OR DNMT2) OR DNMT3A) OR DNMT3B) OR DNMT3L

#9：Search (((“DNA methylation” [Mesh]) OR DNA methylations) OR methylation, DNA) OR methylations, DNA

#10：#3 OR #4 OR #5 OR #6 OR #7 OR #8 OR #9

#11：#1 AND #2 AND #10

1.4 文獻篩選和資料提取

使用Endnote X9軟件和手動刪除重復文獻之后，由兩位研究者分別進行篩選。首先，兩位研究人員通過閱讀標題、摘要進行獨立篩選，以確定該研究是否保留。所有不確定或可能有相關(guān)記錄的文獻將被保留(比如沒有摘要的會議論文)。接下來兩位研究人員獨立閱讀文獻全文，嚴格根據(jù)納入標準進行篩選。對有爭議的文獻由第三方評價后通過討論求得統(tǒng)一。篩選出的文獻，由兩位研究人員獨立進行數(shù)據(jù)提取。數(shù)據(jù)提取表包含第一作者、發(fā)表年限、國家、研究類型、抽樣方法、樣本量、年齡、檢測方法、細胞種類、論文類型等。由一人核對提取的數(shù)據(jù)，對于不一致的數(shù)據(jù)再次閱讀全文進行確定。

1.5 文獻質(zhì)量評價

由于所納入研究均為病例對照研究，因此使用Newcastle-Ottawa Scale (NOS)量表[20]對納入的研究進行質(zhì)量評價。該量表旨在評估非隨機研究的質(zhì)量，有一個“星級系統(tǒng)”，從3個廣泛的角度對研究進行判斷：研究對象的選擇、組間可比性及病例對照或隊列研究的結(jié)局指標。兩位研究人員獨立進行評價，若結(jié)果出現(xiàn)不一致，則咨詢第三位研究人員進行最終決定。

1.6 統(tǒng)計學方法

Spearman相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient)又稱秩相關(guān)系數(shù)，是利用兩變量的秩次大小進行線性相關(guān)分析的，對原始變量的分布不做要求。相關(guān)系數(shù)r是一個無單位的量值，且-1

最后，輸入Stata 15.0進行數(shù)據(jù)綜合，以r值和95%可信區(qū)間作為Meta分析的效果指標，使用χ2檢驗和I2定量分析確定研究間異質(zhì)性的大小。若P>0.1，I2<50%認為研究間的異質(zhì)性是可以接受的，使用固定效應模型進行合并；若P<0.1，I2>50%認為研究間的異質(zhì)性較大，使用隨機效應模型進行合并。亞組分析或敏感性分析尋找異質(zhì)性的來源，使用Begg’s檢驗與Egger檢驗來確定是否存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果

共檢索出594項研究(英文數(shù)據(jù)庫檢索出105項，中文數(shù)據(jù)庫檢索出489項)，軟件自動剔除重復文獻39項，手動剔除重復研究52項后剩余503項，評估標題和摘要剔除491項，最后剩余的12項由兩位研究人員閱讀全文進行篩選。最后，剔除4篇文獻(1篇無數(shù)據(jù)、1篇數(shù)據(jù)有錯誤、1篇重復發(fā)表、1篇與主題不符合)，共8篇納入了本研究，詳見圖1。

圖1 文獻篩選流程圖

2.2 納入研究的基本特征

納入分析的8項研究均為病例對照研究，有5篇文獻報道了外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中DNMT1表達水平與SLEDAI之間的相關(guān)性，2篇文獻報道了T細胞中DNMT1表達水平與SLEDAI之間的相關(guān)性，1篇文獻報道了CD4+T細胞中DNMT1表達水平與SLEDAI之間的相關(guān)性，詳見表1。

2.3 納入研究的偏倚風險評價結(jié)果

所納入的8項研究均為病例對照研究，使用NOS量表進行評價，均>5顆星。獲得6顆星的文獻有3篇，獲得7顆星的文獻有3篇，獲得8顆星的文獻有2篇，詳見表2。

2.4 Meta分析結(jié)果

2.4.1 DNMT1與SLEDAI的相關(guān)性

納入分析的8篇文獻當中，有3篇文獻認為DNMT1表達水平與SLEDAI之間有相關(guān)性。8項研究共有304名患者，異質(zhì)性檢驗分析顯示P=0.008，I2=63.2%，提示納入的研究間異質(zhì)性較大，meta分析采用隨機效應模型進行合并分析，合并的r=-0.23，95%CI(-0.42，-0.03)，認為DNMT1表達水平與SLEDAI之間有低相關(guān)性，詳見圖2。

圖2 DNMT1與SLEDAI的相關(guān)性森林圖

2.4.2 亞組分析

隨后進行亞組分析，確定異質(zhì)性的潛在來源：①細胞類型：PBMCs、T細胞或CD4+T細胞；②PCR引物：β-acting、PBGD；③NOS得分：6星、7星、8星；④樣本量(中位數(shù)34)：n<34、n≥34；⑤平均年齡(中位數(shù)33.82)：年齡<33.82、年齡≥33.82、未報告；⑥國家：中國、波蘭；⑦SLE診斷標準：1982標準、1997標準。亞組分析結(jié)果顯示：PCR引物與研究的地點可能是異質(zhì)性的主要來源，詳見表3。

表3 亞組分析匯總表

2.4.3 發(fā)表偏倚

使用Begg’s法與Egger法進行發(fā)表偏倚風險分析，P=0.291(Begg’s)、P=0.610(Egger法)提示發(fā)表偏倚不明顯，見圖3。

圖3 發(fā)表偏倚Begg’s檢驗 圖4 敏感性分析

2.4.4 敏感性分析

采用逐一剔除所納入的研究，重新進行合并觀察統(tǒng)計量，來評估結(jié)果的穩(wěn)定性.在排除Mariusz等[16]這一項研究后，I2=0.0%，P=0.871，[r=-0.334，95%CI(-0.458，-0.210)，P<0.05]，說明該研究對于結(jié)果的穩(wěn)定性影響較大，可能是影響異質(zhì)性的重要來源，結(jié)果如圖4。

3 討論

維持甲基化和從頭甲基化是由不同DNMTs催化，有研究證明維持甲基化一般是由DNMT1完成[29]。DNMT2為天門冬氨酸t(yī)RNA的甲基轉(zhuǎn)移酶，具有微弱的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性，DNMT3A和DNMT3B基因分別位于2p23．3和20q11．2，兩者結(jié)構(gòu)域相似，負責從頭合成甲基化，DNMT3A負責修飾裸露DNA，DNMT3B負責核小體核心部位DNA甲基化[30]。DNMT3L缺少C端催化活性區(qū)域，沒有單獨的催化活性，可作為調(diào)節(jié)因子與DNMT3A和DNMT3B相互作用提高它們的催化活性[31,32]。DNMTs在生物體生長發(fā)育不同時期、不同細胞表達不同，其表達異常與SLE的T/B淋巴細胞激活、系統(tǒng)性硬化癥的成纖維細胞表型異常以及抑癌基因高甲基化關(guān)系密切[33,34]，可通過多途徑參與自身免疫性疾病、腫瘤、心腦血管等疾病的發(fā)生發(fā)展[35]。

我們納入的原始研究中正相關(guān)性、負相關(guān)性、無相關(guān)性的結(jié)果都有，不同研究結(jié)果之間的差異較大，r在-4.80與0.4087之間。我們綜合了這些不同結(jié)果的研究之后認為，DNMT1表達水平與SLEDAI之間為負相關(guān)性。有研究認為，由于SLE患者DNMT轉(zhuǎn)錄下調(diào)，可導致CD4+T細胞全基因組的DNA低甲基化和自身免疫反應[36,37]。Farivar等[38]發(fā)現(xiàn)，抑制有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatied protein kinase，MAPK)信號通路可降低DNMT1活性，從而引起T細胞DNA的低甲基化，并參與SLE的發(fā)病。因此，有可能通過調(diào)節(jié)DNMT轉(zhuǎn)錄，影響DNA低甲基化的狀態(tài)，從而降低SLEDAI。

異質(zhì)性檢驗分析顯示P=0.008，I2=63.2%，提示納入的研究間異質(zhì)性較大。通過亞組分析和敏感性分析可知，排除Mariusz等[16]這一項研究后異質(zhì)性明顯下降，說明該研究對于結(jié)果的穩(wěn)定性影響較大，可能是影響異質(zhì)性的重要來源。該項研究所使用的內(nèi)參蛋白膽色素原脫氨酶(porphobilino gendeaminase，PBGD)與其他研究不一樣，可能是造成異質(zhì)性的原因。其他可能存在異質(zhì)性的原因有研究人群的不同、研究儀器的不同、試劑的不同、DNMT1測定方法的不同等。

本次研究設計和原始研究本身存在一些局限性和不足之處。每個原始研究的納入樣本量較少，在28～74人，可能會影響本次研究結(jié)果。雖然納入的原始研究陰性和陽性結(jié)果均有，但是正相關(guān)性的研究只有1個。其原因可能是結(jié)果為陰性和不顯著的研究未提交或被拒絕，進而造成本次研究結(jié)果的偏差。本次研究只檢索了7個數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)庫中所收錄的文章只包含了中文和英文出版的文章，可能存在選擇偏倚。在meta分析中排除灰色文獻的解釋可能會導致對干預效果的夸大估計[39]。雖然本研究對灰色文獻進行了檢索，但并未發(fā)現(xiàn)符合納入標準的文獻。

綜上所述，根據(jù)目前可用的證據(jù)表明，DNMT1表達水平與SLEDAI之間存在負相關(guān)性。SLE目前仍缺乏判斷疾病活動性、預后的特異性生物學標記物，未來可以探究DNA甲基化水平改變的原因和作用機制，為SLE的診斷、治療、預后、監(jiān)測等提供有效的分子靶標。