笪玉榮

(江漢大學 醫(yī)學院， 湖北 武漢 430000)

腹痛是臨床最常見的癥狀之一，其病因復雜，可由腹腔多種器官或者組織的病理性改變所致。臨床診治中對其病因判斷的難度較大，常需結(jié)合患者的腹痛部位、腹痛性質(zhì)、伴隨癥狀等進行綜合判斷。此外，臨床急癥中急性炎癥性腹痛起病急、進展快、病情多變，若治療不及時，常造成不良后果[1]。

目前，腹痛主要通過鎮(zhèn)痛、抗感染、維持水/電解質(zhì)和酸堿平衡等方法進行治療，嚴重時可采取手術(shù)。這一系列治療方法雖然臨床療效尚可，但存在一定的局限性。尤其是近些年隨著抗生素的濫用導致耐藥率的增加。同時，在處理不能耐受手術(shù)等有創(chuàng)操作的患者時，治療效果欠佳[2]。既往研究表明，中醫(yī)藥在治療危急重癥以及慢性腹痛方面大有可為。多種方劑或者中成藥能有效治療急、慢性腹痛，且患者獲益較多。沉香具有行氣止痛的功效，但關(guān)于沉香治療急、慢性腹痛的研究報道較少，尤其缺乏藥物的生物功能研究。因此，本研究針對單藥沉香的有效成分，結(jié)合當前生物信息學方法，探討其治療腹痛的靶點分子，并進一步預測可能涉及的功能以及生物信號通路。

1 方法

1.1 中藥有效成分和靶點預測、注釋

采用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)對沉香的有效成分進行篩選。本研究中涉及的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30；類藥性(drug-likeness，DL)>0.18。篩選成份后在此網(wǎng)站進行疾病靶點的預測。并將以上所得結(jié)果導出，備用。在獲得上述靶點以后，采用Perl語言對靶點基因identification(ID)進行轉(zhuǎn)換，并通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)比對，獲得GeneSymbol。

1.2 疾病靶點預測

本研究針對腹痛分別檢索了2個數(shù)據(jù)庫，GeneCards (https://www.genecards.org/)和Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，https://omim.org/)。

1.3 藥物靶點與疾病靶點比對

基于以上兩步分析，分別獲得藥物的靶點分子和疾病的靶點分子。疾病(腹痛)和藥物(沉香)聯(lián)合，將以上獲得的兩個靶點分子求交集，并采用R語言“VennDiagram”包繪制韋恩圖。進一步采用Cytoscape軟件，將中藥網(wǎng)絡(luò)藥理可視化呈現(xiàn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及富集分析

為進一步探討藥物的生物學功能，本研究將已經(jīng)交集化獲得的靶點帶入STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=rXdZZCcF2Y5a &input_page_show_search=on)進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(protein-protein interaction network，PPI)。主要參數(shù)設(shè)置為：minimum required interaction score: highest confidence (0.900)。所得核心基因的PPI采用Cytoscape軟件進行可視化呈現(xiàn)。

富集分析主要涉及生物學功能以及通路分析。兩者分別通過The Gene Ontology (GO, https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)以及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG, https://www.kegg.jp/)分析完成。富集分析的結(jié)果采用R語言“clusterProfiler”包可視化呈現(xiàn)。

1.5 統(tǒng)計學方法

此次研究涉及的數(shù)據(jù)均采用R語言以及生物信息網(wǎng)站自帶統(tǒng)計功能進行運算?；?、通路等篩選過程中，均以校正后P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 沉香有效成分和靶點預測、疾病靶點預測

共篩選出符合要求的沉香有效成份8個，疾病相關(guān)靶點214個，藥物相關(guān)靶點87個。以沉香和腹痛作為中介，求交集后構(gòu)建沉香主要成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)，共篩查到69個基因與疾病和藥物均有聯(lián)系。本研究對單藥有效成分的參數(shù)主要涉及相對分子量(molecular weight，MW)、脂水分配系數(shù)的對數(shù)值(AlogP)、氫鍵供體(Hdon)、 氫鍵受體(Hacc)、 OB、腸上皮滲透性(Caco-2)、血腦屏障(blood brain barrier，BBB)、類藥性(drug-likeness，DL)、負表面積(FASA-)以及藥物半衰期(half life，HL)，具體結(jié)果見表1。藥物與疾病靶點交集的韋恩圖見圖1A，藥物、有效成份、癥狀及共同作用的靶點網(wǎng)絡(luò)體系見圖1B。

表1 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫沉香單藥的有效成分預測

2.2 PPI以及富集分析

根據(jù)沉香主要成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)共篩查到69個基因，將這69個基因帶入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2A)。為進一步從PPI中獲取核心基因，我們對蛋白之間的相互聯(lián)系進行計數(shù)。與其他蛋白連接數(shù)量最多的分別是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)(12次)、CCND1(11次)、ESR(11次)以及RELA(10次)(圖2B)，這些蛋白對應(yīng)的基因與其他基因相比，基因之間的相關(guān)性更多，其功能在網(wǎng)絡(luò)中可能扮演核心基因的作用。

注：A：藥物有效成分的靶點預測與疾病相關(guān)靶點預測的韋恩圖； B：沉香的有效成分、作用靶點以及藥物靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖圖1 沉香有效成分和靶點預測、疾病靶點預測

注：A：基于STRING數(shù)據(jù)庫結(jié)果，Cytoscape進一步構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖； B：蛋白之間的相關(guān)連接數(shù)量圖2 成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)所涉及69個基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

利用DAVID(https://david.Ncifcrf.gov/) 網(wǎng)站對成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)所涉及的69個基因功能進行富集分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，69個基因分別富集在100個功能上，其中Count數(shù)排前十的GO詳見表2。分別為：①轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity)，RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合(RNA polymerase II proximal promoter sequence-specific DNA binding)；②DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性(DNA-binding transcription activator activity)，RNA聚合酶Ⅱ特異性(RNA polymerase II-specific)；③泛素樣蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin-like protein ligase binding)；④泛素蛋白連接酶結(jié)合(ubiquitin protein ligase binding)；⑤近端啟動子DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性(proximal promoter DNA-binding transcription activator activity)，RNA聚合酶Ⅱ特異性(RNA polymerase II-specific)；⑥RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(RNA polymerase II transcription factor binding)；⑦蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)；⑧類固醇結(jié)合(steroid binding)；⑨激酶調(diào)節(jié)活性(kinase regulator activity)；⑩輔因子結(jié)合(cofactor binding)。R軟件對其富集結(jié)果的可視化呈現(xiàn)見圖3。

圖3 成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)所涉及69個基因的功能富集結(jié)果

表2 核心基因的功能聚集(Count數(shù)排前十的ID)

進一步對成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)所涉及69 個基因的功能進行 KEGG 通路分析。在通路富集分析中，根據(jù) FDR值篩選出 Top 5條信號通路(見圖4)。具體的通路結(jié)果詳見表3。分別為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥性(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、內(nèi)分泌抵抗(endocrine resistance),鉑抗藥性(platinum drug resistance)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)以及MAPK信號通路 (MAPK signaling pathway)。

表3 核心基因涉及的信號通路

圖4 成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)所涉及69個基因的KEGG通路富集結(jié)果

3 討論

腹痛是臨床常見的癥狀，也是促使患者就診的重要原因。腹痛多由腹內(nèi)組織或器官受到某種強烈刺激或損傷所致，也可由胸部疾病及全身性疾病所致。此外，腹痛又是一種主觀感覺，腹痛的性質(zhì)和強度，不僅受病變情況和刺激程度影響，而且受神經(jīng)和心理等因素的影響。即患者對疼痛刺激的敏感性存在差異，相同病變的刺激在不同的患者或同一患者的不同時期引起的腹痛，在性質(zhì)、強度及持續(xù)時間上有所不同。臨床急性腹痛常見于腹腔內(nèi)臟器疾病、腹壁疾病、胸腔疾病以及全身性疾病，而慢性腹痛常見于慢性炎癥、胃腸疾病、腹腔內(nèi)臟器的扭轉(zhuǎn)或梗阻、包膜張力增加以及胃腸運動功能障礙等。以往臨床上通常會采用西醫(yī)常規(guī)治療，如止痛、抑酸以及手術(shù)等。但是多數(shù)研究顯示，這些治療方法(如采用質(zhì)子泵抑制劑)可能提高腸道感染發(fā)生率，尤其是對部分年齡較大或病情較重的患者，更難以獲得理想的臨床療效[3,4]。

沉香具有“行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘”的功效，其在脾胃病領(lǐng)域主要用于胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆等癥的治療。既往有文獻已經(jīng)證實，沉香在治療腹痛各種病癥中的效果，最為典型的就是沉香止痛散在胃痛方面的應(yīng)用[5,6]。此外，沉香化氣丸以及復方陳香胃片等成藥在胃潰瘍的治療中，也展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢[7,8]。

現(xiàn)代藥理學研究表明，沉香對多種消化系統(tǒng)疾病(如呃逆、胃潰瘍、消化不良、便秘、腸梗阻等)具有多重療效，其主要功能涉及鎮(zhèn)痛、抗炎以及抗氧化等[9-12]。劉洋洋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，沉香醇提物在腸推進、胃排空及抗胃潰瘍方面均具有顯著性作用。分析其原因可能與沉香具有“行氣”、“溫中”的作用，能舒暢氣機、祛除寒邪有關(guān)，同時增強胃腸動力也可能是其中的原因之一[13]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)所涉及69個基因的KEGG通路分別富集于為EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性、內(nèi)分泌抵抗、鉑抗藥性、ErbB以及MAPK信號通路。既往研究[14]發(fā)現(xiàn)，脾虛是潰瘍發(fā)生和復發(fā)的根本因素，EGFR、局部炎性細胞因子浸潤被認為是潰瘍愈合重要的影響因素。ErbB信號通路參與了胃部多項生理功能，其信號轉(zhuǎn)導的失調(diào)會導致胃潰瘍甚至胃癌的發(fā)生和發(fā)展[15-23]。MAPK在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，是不同膜受體與細胞核之間聯(lián)系最重要的信號途徑[24]。上調(diào)MYC在人胃癌細胞中的表達，可抑制MAPK信號通路活化，進而阻滯胃癌細胞的遷移和侵襲[25]。

本研究通過中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，對沉香治療腹痛作用機制進行了初步探討。采用構(gòu)建成分-靶點-疾病核心網(wǎng)絡(luò)的方法篩選到69個基因。通過對這些基因進行分析，我們發(fā)現(xiàn)沉香治療腹痛可能涉及的生物學功能。更重要的是，我們通過KEGG通路富集找到了相關(guān)的信號通路，這些通路中較為常見的ErbB以及MAPK信號通路與胃潰瘍、胃炎以及胃癌等有密切的相關(guān)性。但是，本研究也存在一定的局限性。由于研究的數(shù)據(jù)均來自數(shù)據(jù)庫，因此缺少臨床研究數(shù)據(jù)作為佐證。另外，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學對藥物的靶點預測，這種統(tǒng)計學的結(jié)果可能存在一定的假陽性，需要實驗數(shù)據(jù)進行下一步驗證。即便如此，隨著生物信息學尤其是中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學的普遍應(yīng)用，使得我們對常見藥物(如沉香)的藥理學研究有了更進一步認識。這為揭示沉香在治療腹痛等相關(guān)疾病中涉及的分子機制提供了新的思路。