吳文靜

（安徽省公安教育研究院，安徽 合肥230031）

黃頂菊[Flaveria bidentis(L.)Kuntze.]是1年生草本植物，屬于菊科堆心菊族黃菊屬(Flaveria Juss)，最先生長在南美洲，后慢慢擴(kuò)散到北美洲南部、美洲中部等地，后又慢慢傳播至非洲各地以及西班牙、英國、法國、日本等地[1]。它的繁殖速度十分迅速，夏季至秋季甚至全年它都可能處于花果期。黃頂菊入侵我國的時(shí)間較晚，2001年在衡水湖畔被發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)在山東、河北、天津等多個(gè)省市出現(xiàn)[2]。目前國內(nèi)對黃頂菊的研究多集中于生物學(xué)、危害性、發(fā)生特點(diǎn)等方面，獲得了較多關(guān)于黃頂菊成分的研究成果[3-5]。

黃頂菊入侵我國后，它的生長環(huán)境及生長行為與原產(chǎn)地有很大差異，很可能與本地品種雜交產(chǎn)生變種，不同地區(qū)的黃頂菊主要成分可能存在一定差異，因此深入研究不同地區(qū)黃頂菊主要化學(xué)成分及其含量，可為物種的精準(zhǔn)鑒別提供化學(xué)依據(jù)，并可以進(jìn)一步深入探討其是否發(fā)生變種。

通過分析發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物是黃頂菊中含量較多的化合物，而分析黃酮類成分的最優(yōu)方式是高效液相色譜法[6]。高效液相色譜也是常見的植物有效成分分析手段，同其他色譜方法相比，具有較多優(yōu)勢，例如選擇性較高、靈敏度較高、應(yīng)用范圍較廣等[7]。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化了高效液相色譜檢測條件的基礎(chǔ)上，對4個(gè)地區(qū)12個(gè)不同批次的黃頂菊樣品進(jìn)行檢測，比較其主要成分及含量上的差異，為防控治理、綜合應(yīng)用及物種鑒定提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

表2 實(shí)驗(yàn)試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品

編號1-3號樣品來源地為北京（中國農(nóng)科院），編號4-6號樣品來源地為河北，編號7-9號樣品來源地為天津，編號10-12號樣品來源地為山東。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6mm×250mm,5μm）色譜柱。

進(jìn)樣量：10μL。

1.3.2 樣品溶液的制備

首先粉碎自然晾干后的黃頂菊樣品，包括根、莖、葉、花，并通過分析選取了最合適的80目篩進(jìn)行粗制過濾，篩除大雜質(zhì)后稱取1.0g，加入80%乙醇的體積為50ml，將兩者相溶攪拌，用80℃水浴進(jìn)行2次回流，用100ml容量瓶進(jìn)行定容，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，備用。

1.3.3 對照品溶液制備

取萬壽菊素葡萄糖苷，金絲桃苷，6-甲氧基山奈酚糖苷，紫云英苷，三連噻吩適量于容量瓶中配置成0.048mg/mL金絲桃苷，0.079mg/mL萬壽菊素葡萄糖苷,0.091mg/mL的紫云英苷的混合標(biāo)準(zhǔn)品,0.038mg/mL 6-甲氧基山奈酚葡萄糖苷及0.016mg/mL的噻吩。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相體系的選擇

選擇不同的流動相體系對植物的復(fù)雜成分分離有著不同的影響，以下實(shí)驗(yàn)按照1.3.2的方法制備黃頂菊樣品溶液，選擇相同的實(shí)驗(yàn)條件及標(biāo)準(zhǔn)，考察不同的流動相下黃頂菊主要成分的色譜分離情況，見表3，表4。

表3 梯度條件A

表4 梯度條件B

結(jié)果表明分離效果受加入酸的影響，不同濃度的酸會出現(xiàn)不同的效果，例如乙腈-0.2%乙酸水體系，峰形不理想；乙腈-TFA水體系，出峰數(shù)較多，且基線穩(wěn)定，峰形較為理想。通過調(diào)節(jié)TFA的濃度改善分離效果，最終確定乙腈-0.0125%TFA水體系能得到好的分離效果。

2.1.2 檢測波長的選擇

實(shí)驗(yàn)按照1.3.2的方法制備黃頂菊樣品溶液，選擇同一流速、柱溫、色譜柱，選取不同規(guī)格的SPDM20A二極管陣列檢測器，檢測黃頂菊色譜峰的數(shù)量及分離情況。結(jié)果表明：254nm波長下，峰數(shù)較少，說明檢測波長254nm下，被檢測出來的黃頂菊的成分較少；而280nm及320nm波長下基線不穩(wěn)定，且峰形不理想；360nm波長下，可以檢測出含有的各種成分?？紤]多種因素的影響，黃頂菊HPLC分析的檢測波長確定基線為360nm。

2.1.3 確定最優(yōu)檢測條件

通過對以上幾個(gè)影響色譜分離因素的優(yōu)化考察，最后確定選擇梯度條件為0-25min，14%-18%；25-50min，18%-95%；50-56min，95%；57-65min，14%；流動相可選較多，選取最為合適的乙腈-0.0125%TFA水體系，并以360nm作為檢測波長，選取1mL/min的流速，柱溫為30℃，作為黃頂菊HPLC圖譜研究的色譜分離條件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該條件簡單、分析快速、重復(fù)性和穩(wěn)定性好。

2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

按1.3.3準(zhǔn)備對照品溶液，按2.1.3色譜條件操作，進(jìn)樣10μL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖，如圖1所示。其中1號峰、2號峰、3號峰、4號峰、5號峰分別為金絲桃苷、萬壽菊素葡萄糖苷、紫云英苷、6-甲氧基山奈酚糖苷、α-三連噻吩。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取1.3.2項(xiàng)下中國農(nóng)科院黃頂菊的樣品溶液，根據(jù)2.1.3色譜操作程序進(jìn)行操作，記錄4種黃酮苷、α-三連噻吩峰面積，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果如表5。從表5可以看出此方法的精密度良好，符合HPLC圖譜的要求。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)（a）保留時(shí)間的RSD值

2.3.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取黃頂菊葉適量5份，分別按1.3.2項(xiàng)下方法制備中國農(nóng)科院黃頂菊葉的樣品溶液，按2.1.3色譜條件操作，記錄供試品溶液HPLC圖譜中4種黃酮苷及α-三連噻吩的峰面積，計(jì)算其RSD值，結(jié)果見表6，表明本方法重現(xiàn)性較好，基本符合HPLC圖譜研究的要求。

表6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)（a）保留時(shí)間的RSD值

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1.3.2項(xiàng)下中國農(nóng)科院黃頂菊葉的樣品溶液，按2.1.3色譜條件操作，分別于0、4、8、12、16、24h進(jìn)樣，測定HPLC圖譜中4種黃酮苷及α-三連噻吩的峰面積，計(jì)算其RSD值，見表7，結(jié)果表明本方法符合HPLC研究的要求，在溶劑中24h內(nèi)穩(wěn)定。

表7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（a）保留時(shí)間的RSD值

2.3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取1.3.2項(xiàng)下農(nóng)科院黃頂菊的樣品溶液，按2.1.3色譜條件操作，觀察HPLC圖譜，記錄4種黃酮苷的峰面積，分別加入1.5倍、1倍、0.5倍的標(biāo)準(zhǔn)品，記錄并計(jì)算在加入標(biāo)品后的回收情況，結(jié)果見表8。

表8 4種物質(zhì)的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 HPLC圖譜共有模式的建立

進(jìn)行HPLC圖譜研究時(shí)，應(yīng)保障供試品具有一定的代表性，為全面了解植物的基本信息及生長環(huán)境，選取的樣品數(shù)量不應(yīng)低于10批。本實(shí)驗(yàn)共選擇了4個(gè)產(chǎn)地及12個(gè)不同批次，符合研究的規(guī)定。用1.3.2項(xiàng)的方法制備不同地區(qū)不同批次的黃頂菊葉的樣品溶液12批，按2.1.3色譜條件操作，分別測定它們的指紋圖譜。綜合所有樣品指紋圖譜，標(biāo)定黃頂菊12個(gè)共有指紋峰，如圖2所示。

圖2 黃頂菊HPLC圖譜共有模式

黃頂菊HPLC1圖譜特征峰如表9所示。

表9 黃頂菊HPLC圖譜特征峰表

2.5 不同地區(qū)黃頂菊的圖譜分析及4種黃酮苷含量比較

2.5.1 HPLC圖譜分析

圖3 12批次黃頂菊HPLC圖譜比較

通過分析結(jié)果可知，不同環(huán)境不同批次的黃頂菊仍存在較高的化學(xué)成分相似度，但含量存在一定區(qū)別，河北地區(qū)的黃頂菊同平均標(biāo)準(zhǔn)存在差異，山東地區(qū)的同平均標(biāo)準(zhǔn)最為相似。

2.5.2 4種黃酮苷含量比較

取1.3.2項(xiàng)下4個(gè)地區(qū)黃頂菊的樣品溶液，按2.1.3色譜條件操作，測定指紋圖譜中4種黃酮苷的峰面積，按照標(biāo)線分別計(jì)算含量，結(jié)果如表10，可以看出金絲桃苷、紫云英苷及6-甲氧基山奈酚糖苷的含量次序都為：河北>山東>北京>天津，萬壽菊素葡萄糖苷的含量次序?yàn)椋汉颖?北京>山東>天津。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

表10 不同地區(qū)黃頂菊樣品中4種黃酮苷含量比較

3 結(jié)論

本文研究優(yōu)化了高效液相色譜測定黃頂菊有效成分的方法，最佳色譜檢測條件為洗脫順序是乙腈-0.0125%TFA水體系：0-25min,14%-18%；25-50min，18%-95%；50-56min，95%；57-65min，14%，并以360nm作為檢測波長。在最佳檢測條件下，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在HPLC圖譜的檢測分析要求范圍內(nèi)，確保了檢測方法的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

通過對4個(gè)地區(qū)不同批次的黃頂菊樣品進(jìn)行HPLC圖譜分析，結(jié)果表明：同一地區(qū)不同批次的黃頂菊葉HPLC圖譜基本相同，不同地區(qū)的黃頂菊主要化學(xué)成分相同，但在含量上有些差異。金絲桃苷、紫云英苷及6-甲氧基山奈酚糖苷的含量次序都為：河北>山東>北京>天津，萬壽菊素葡萄糖苷的含量次序?yàn)椋汉颖?北京>山東>天津。將HPLC指紋圖譜研究和主成分含量測定結(jié)合在一起，可以為黃頂菊的物種鑒別提供化學(xué)依據(jù)，對黃頂菊的化學(xué)防治和有效利用具有重要的價(jià)值。