張鈺昕，周明艷，謝振蕊，李 麗，李湘怡，劉愛霞，張俊清，李曉亮

（海南醫(yī)學(xué)院1.海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2.天然藥化教研室，海南海口571199）

膽木為茜草科烏檀屬喬木烏檀（Nauclea offici?nalisPierre. ex Pitard）干燥的莖干和根。全年均可采收，砍成塊片，曬干［1］，其味苦、性寒，具有清熱解毒、消腫止痛的功效［2］。膽木為海南特色黎藥，是海南省傳統(tǒng)黎藥重點(diǎn)研究藥材之一。1977 年版中國藥典與2011 年《海南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》記載膽木的藥用部位為干燥莖干及根［3］。膽木民間常用于治療感冒發(fā)燒、肺炎、乳腺炎、泌尿系統(tǒng)感染、腸炎、痢疾、膽囊炎、下肢潰瘍、腳癬感染及皮炎濕疹等病癥［4，5］，外用治療癰癤膿腫［6］。相關(guān)藥理研究發(fā)現(xiàn)，膽木具有抗菌抗病毒及抗氧化［7］、抗炎［8］、抗腫瘤［9］、抗瘧［10］和鎮(zhèn)痛作用［11］?，F(xiàn)代臨床應(yīng)用于治療急性咽喉炎、急性結(jié)膜炎及上呼吸道感染等疾?。?2］。

膽木化學(xué)成分的研究結(jié)果表明，該植物成分主要包括有生物堿［13］、五環(huán)三萜及其皂苷類［14］、環(huán)烯醚萜類［15］、酚酸類［16］、黃酮［19］和倍半萜［16］等化合物。其中生物堿為膽木的特征性成分，也是其主要的活性成分［17‐19］，目前，關(guān)于使用高效液相色譜‐質(zhì)譜聯(lián)用（LC‐MS）方法測定不同生長階段的膽木莖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究未見報(bào)道。

本研究利用LC‐MS 方法檢測不同生長年限膽木藥材中異長春花苷內(nèi)酰胺、naucleamide B、獐牙菜苷、綠原酸、喜果苷、原兒茶酸、短小舌根草苷、香草酸、隱綠原酸的含量和同一年度不同月份的膽木藥材中異長春花苷內(nèi)酰胺，綠原酸的含量，尋找膽木藥材藥用部位莖干活性成分的變化規(guī)律，初步給出膽木藥材的最佳采收時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、試藥和樣品

儀器：Prominence UFLC 液相色譜儀，日本島津公司；通過Turbo V 離子源接口串聯(lián)AB‐SCIEX API 4000+串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，Analyst 軟件控制數(shù)據(jù)采集和處理，美國AB 公司；XS105DU 十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒‐托利多公司；Lab Tower EDI 15 超純水一體機(jī)（Thermo fisher 公司）；KQ‐100v 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

試劑：甲醇（HPLC 級）購自德國默克公司，甲酸（HPLC 級）購自Thermo fisher 公司；超純水（超純水機(jī)自制）。其他試劑均為分析純級。

試藥：異長春花苷內(nèi)酰胺、naucleamide B、喜果苷、短小蛇根草苷單體為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)ODS 色譜柱洗脫提取，經(jīng)核磁、質(zhì)譜等鑒定，純度均大于98%；對照品獐牙菜苷、綠原酸、隱綠原酸、香草酸及原兒茶酸均購買自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度均大于98%。

樣品：不同生長年限的膽木莖干均采自海南省瓊中縣（采收1、2、3、5、8、9～10、11、14 年生膽木莖干部位，共8 批，24 個(gè)樣品）。

同一年度不同月份的膽木莖干均采自海南省瓊中縣（采收時(shí)間為2018.06.19～2019.06.11，每半個(gè)月采收一次，共26 批，78 個(gè)樣品）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 采用菲羅門Kinetex 5 μm Evo C18100? 色譜柱（2.10 mm×50 mm，5 μm），柱溫40 ℃，以水（含0.1%甲酸A）‐甲醇（B）流動(dòng)相梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～0.50 min（5%B），0.50～0.51 min（40%B），0.51～5.00 min（95%B），5.00～5.01 min（5%B），5.01～6.00 min（5%B）；流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子檢測，GS1 為35 psi，GS2 為45 psi，簾氣為30 psi，噴霧溫度為600 ℃。各化合物優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)見表1、2。

表1 各化合物優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)（年限）Tab 1 Multi?reaction monitoring（MRM）parameters（years）for each compound optimization

1.3 溶液的制備

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取9 個(gè)化合物對照品異長春花苷內(nèi)酰胺，naucleamide B ，獐牙菜苷，綠原酸，喜果苷，原兒茶酸，短小舌根草苷，香草酸，隱綠原酸各5 mg 置10 mL 容量瓶，加甲醇溶解至刻度得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取混合得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲(chǔ)存于?20℃，備用。

精密稱取化合物對照品異長春花苷內(nèi)酰胺，綠原酸各5 mg 置10 mL 容量瓶，加甲醇溶解至刻度得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。儲(chǔ)存于?20 ℃，備用。

1.3.2 樣品溶液的制備 精密稱取晾干粉碎后的莖皮樣品0.5 g，加入甲醇（40∶1，v/w），超聲波提取30 min。提取液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾取2 mL 冷藏存于?20 ℃冰箱中。濾液原液、濾液50、80 倍稀釋后，分別5 μL 進(jìn)樣分析。

表2 各化合物優(yōu)化多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）參數(shù)（月份）Tab 2 Multi?reaction monitoring（MRM）parameters（months）for each compound optimization

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 不同生長年限：采用外標(biāo)法繪制9 個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。根據(jù)要求將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，進(jìn)樣，得各化合物定量限（LOQ）。9 個(gè)化合物在各自線性范圍線性良好（r>0.990 4）（表3），對照品溶液和膽木提取液LC–MS/MS 色譜圖見圖1、2。

表3 9 種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Tab 3 Regression equation correlation coefficient and linear range of nine compounds

圖1 對照品溶液LC‐MS/MS 色譜圖Fig 1 LC?S/MS chromatogram of reference solution

圖2 提取液LC‐MS/MS 色譜圖Fig 2 LC?S/MS chromatogram of extract solution

同一年度不同月份：采用外標(biāo)法繪制2 個(gè)化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程及相關(guān)系數(shù)。根據(jù)要求將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，進(jìn)樣，得各化合物L(fēng)OD 和LOQ。2 個(gè)化合物在各自線性范圍線性良好（r>0.990 4）（表4），對照品溶液和膽木提取液LC‐MS/MS 色譜圖見圖3、4。

表4 2 種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Tab 4 Regression equation correlation coefficient and linear range of the two compounds

圖3 對照品溶液LC–MS/MS 色譜圖Fig 4 LC?S/MS chromatogram of reference solution

1.4.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率實(shí)驗(yàn) 將一定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品單日連續(xù)進(jìn)樣6 次分析，計(jì)算各個(gè)化合物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察精密度；分別考察9 個(gè)化合物的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性（表5）。其精密度RSD 范圍為1.3%～8.0%。

取膽木莖干提取液，分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣分析，計(jì)算各化合物濃度的RSD 值考察穩(wěn)定性；膽木莖干中化合物的穩(wěn)定性RSD 范圍為0.8%～6.0%。

圖4 提取液LC–MS/MS 色譜圖Fig 4 LC?S/MS chromatogram of extract solution

取膽木莖干提取液，各6 份，進(jìn)樣分析，計(jì)算各個(gè)化合物濃度的RSD 以考察重復(fù)性。膽木莖干中化合物的重復(fù)性RSD 范圍為0.9%～9.1%。

精密稱取已知含量膽木莖干0.5 g，向已知濃度樣品中加入一定量的已知濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣檢測，按照加樣回收率公式計(jì)算：回收率（%）=（測得量‐原有量）/加入量×100% 。同時(shí)，考察在已知濃度的膽木莖干樣品中加入9 個(gè)化合物后的加樣回收率，見表5。9 個(gè)化合物的加樣回收率平均值的范圍為99.20%～102.55%，且其RSD 范圍為1.06%～3.75%。表明本方法穩(wěn)定，可靠。

表5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率結(jié)果Tab 5 Precision，repeatability，stability and recovery results

1.5 樣品測定

采集不同生長年限，以及同一年度不同月份的膽木藥材樣品，采用LC‐MS 法進(jìn)行檢測，結(jié)果使用GraphPad Prism 8 軟件繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 不同生長年限

采集膽木莖干樣品為：1、2、3、5、8、9～10、11、14年生共24 份樣品。樣品分析測試中，未能檢測到原兒茶酸和香草酸（檢測限：原兒茶酸0.197 μg/g、香草酸0.003 2 μg/g），含量很少。膽木莖干在幼年期，測定的6 種活性成分含量都較低，在第3 年生長期時(shí)，6 種化學(xué)成分的含量有所升高，到第5 年，含量增長趨于穩(wěn)定。隨著生長年限延長，其各化學(xué)成分含量是比較穩(wěn)定的狀態(tài)。膽木中異長春花苷內(nèi)酰胺等6 種活性成分含量情況折線圖，見圖5、表6。

圖5 不同生長年限膽木藥材中各成分含量變化趨勢圖Fig 5 Trend chart of changes in the content of various components in Nauclea officinalis of different years

表6 不同生長年限膽木莖干中化學(xué)成分的含量（μg/g，n=3，±s）Tab 6 Contents of chemical constituents in stem of Nauclea officinalis of different growth year（μg/g，n=3，±s）

表6 不同生長年限膽木莖干中化學(xué)成分的含量（μg/g，n=3，±s）Tab 6 Contents of chemical constituents in stem of Nauclea officinalis of different growth year（μg/g，n=3，±s）

年限1 年生2 年生3 年生5 年生8 年生9～10 年11 年生14 年生獐芽菜苷 Rsd(%)喜果苷 Rsd(%)綠原酸 Rsd(%)短小舌根草苷 Rsd(%)異長春花苷內(nèi)酰胺 Rsd(%)隱綠原酸 Rsd(%)1.323±0.101 2.077±0.333 3.687±0.851 9.293±0.154 6.493±1.745 4.479±0.740 5.886±1.949 20.34±8.760 7.60 16.05 23.08 1.66 26.87 16.47 33.11 43.09 1.864±0.249 1.452±0.237 3.113±0.795 12.804±1.752 24.38±10.08 16.25±11.24 13.300±4.032 13.516±3.959 13.34 16.32 25.55 13.69 41.33 69.18 30.31 29.29 12.493±1.078 9.319±1.656 8.362±1.801 31.7282±0.45 177.781±1.53 79.83±1.60 136.00±7.03 96.57±5.35 8.63 17.77 21.54 64.44 6.49 2.00 5.17 5.54 0.929±0.092 0.783±0.097 2.722±0.603 25.78±0.12 65.37±5.66 57.06±3.04 46.01±4.90 52.21±2.69 9.93 12.41 22.14 0.48 8.66 5.34 10.65 5.15 202.75±25.76 79.86±14.57 2 060.9±677.4 13 841.73±606.83 13 296.94±2304.79 13 730.43±288.53 23 317.39±1091.36 17 730.43±375.62 12.71 18.24 32.87 4.38 17.33 2.10 4.68 2.12 1.53±0.08 1.83±0.44 2.15±0.51 8.578±1.806 10.89±4.24 7.755±1.857 15.67±5.18 10.52±3.42 5.15 23.86 23.78 21.06 38.90 23.95 33.04 32.48

2.2 同一年度不同月份

采集膽木莖干樣品2018.06.19～2019.06.11，共26 批，78 個(gè)膽木莖干樣品，膽木莖干中活性成分異長春花苷內(nèi)酰胺的含量大約比綠原酸含量高一到二個(gè)數(shù)量級，綠原酸含量在1 年中處于波動(dòng)狀態(tài)，1年內(nèi)出現(xiàn)3 個(gè)含量最高點(diǎn)。異長春花苷內(nèi)酰胺和綠原酸含量情況，見圖6、表7。

表7 不同采集月份膽木藥材中代表性化學(xué)成分含量情況（μg/g，n=3，±s）Tab 7 The representative chemical composition content of Nauclea officinalis in different collection months（μg/g，n=3，±s）

表7 不同采集月份膽木藥材中代表性化學(xué)成分含量情況（μg/g，n=3，±s）Tab 7 The representative chemical composition content of Nauclea officinalis in different collection months（μg/g，n=3，±s）

日期異長春花苷內(nèi)酰胺 RSD(%)綠原酸 RSD(%)2019‐01‐03 2019‐01‐15 2019‐01‐29 2019‐02‐12 2019‐02‐26 2019‐03‐12 2019‐03‐26 2019‐04‐09 2019‐04‐26 2019‐05‐07 2019‐05‐28 2019‐06‐11 2018‐06‐19 2018‐07‐03 2018‐07‐17 2018‐07‐31 2018‐08‐14 2018‐08‐28 2018‐09‐11 2018‐09‐25 2018‐10‐09 2018‐10‐23 2018‐11‐06 2018‐11‐26 2018‐12‐04 2018‐12‐20 29 690.00±8 560.00 53 740.00±14 690.00 10 180.00±3 270.00 36 990.00±16 100.00 30 490.00±9 110.00 32 240.00±27 420.00 42 670.00±7 580.00 38 960.00±28 860.00 52 580.00±18 490.00 60 840.00±21 280.00 45 100.00±9 120.00 29 580.00±9 550.00 36 760.00±8 890.00 10 610.00±2 270.00 9 420.00±1 943.00 12 040.00±3 000.00 9 400.00±1 790.00 13 750.00±2 790.00 13 490.00±2 800.00 18 840.00±2 860.00 18 800.00±5 300.00 21 130.00±7 380.00 24 950.00±3 380.00 28 240.00±22 660.00 35 580.00±26 230.00 16 530.00±4 440.00 28.83 27.34 32.12 43.53 29.88 85.05 17.76 74.08 35.17 34.98 20.22 32.29 24.18 21.39 20.63 24.92 19.04 20.29 20.76 15.18 28.19 34.93 13.55 80.24 73.72 26.86 1 243.21±678.99 952.7±368.79 559.11±600.92 4 704.29±4 057.23 878.26±549.39 548.77±197.16 2 246.74±1 988.5 938.33±1 041.52 1 591.19±1 137.32 3 695.43±3 123.63 3 093.46±1 158.64 1 263.26±1 681.52 8 392.42±6 312.76 246.95±88.42 692.13±355.37 176.19±30.49 611.83±345.85 1 434.38±361.17 6 702.77±3 114 5 489.45±2 500.07 5 964.12±4 242.37 398.58±102.07 412.34±227.35 1 659.6±2 207.38 2 578.73±2 165.1 255.79±57.18 54.62 38.71 107.48 86.25 62.55 35.93 88.51 111.00 71.48 84.53 37.45 133.11 75.22 35.80 51.34 17.31 56.53 25.18 46.46 45.54 71.13 25.61 55.14 133.01 83.96 22.35異長春花苷內(nèi)酰胺/綠原酸(含量比)23.88 56.41 18.21 7.86 34.72 58.75 18.99 41.52 33.04 16.46 14.58 23.42 4.38 42.96 13.61 68.34 15.36 9.59 2.01 3.43 3.15 53.01 60.51 17.02 13.80 64.62

圖6 不同月份膽木藥材中各成分含量變化趨勢圖Fig 6 Trend chart of the content of each component in Nauclea officinalis in different collection months

3 討論

不同生長年限的膽木在幼年期，測定的6 種活性成分含量均較低，在3 年生長期后，6 種化學(xué)成分的含量開始同步升高，到5 年生長期后，含量趨于穩(wěn)定。5 年以上生長期的膽木藥材，其各化學(xué)成分含量是比較穩(wěn)定的狀態(tài)。生長年限在5 年以上的膽木，其莖中各成分含量達(dá)到了一個(gè)較高且穩(wěn)定的水平。應(yīng)采集5 年生以上的膽木作為藥材原料。

同一年度不同月份的膽木莖干中主要含生物堿和酚酸類兩類活性成分，相比之下，異長春花苷內(nèi)酰胺的含量大約比綠原酸含量高一到二個(gè)數(shù)量級，且生物堿為膽木藥材更為重要的活性成分，綠原酸含量在1 年中處于波動(dòng)狀態(tài)，1 年內(nèi)出現(xiàn)3 個(gè)含量最高點(diǎn)，很難依據(jù)該成分的含量來確定膽木藥材的品質(zhì)。因此，以生物堿代表性活性成分異長春花苷內(nèi)酰胺含量高低評價(jià)膽木藥材的品質(zhì)更具有現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)于膽木藥材的采收時(shí)間，原有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定全年采收［1］，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測定不同活性成分含量得知，以異長春花苷內(nèi)酰胺含量高而穩(wěn)定的月份即每年的5月作為膽木一年內(nèi)最佳采收時(shí)間，最佳采收期為每年的10月中旬至次年的6月中旬，或者每年的3～5月。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張鈺昕：提出研究思路、設(shè)計(jì)研究方案、負(fù)責(zé)含量測定方法學(xué)驗(yàn)證、負(fù)責(zé)樣品含量測定、論文起草；周明艷：設(shè)計(jì)研究方案、分析數(shù)據(jù)、論文起草；謝振蕊、李麗：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)材料購買、整理數(shù)據(jù)、采集數(shù)據(jù)；劉愛霞、李湘怡：分析數(shù)據(jù)、處理數(shù)據(jù)；張俊清：提供研究經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)儀器、實(shí)驗(yàn)場地；李曉亮：提供技術(shù)支持、對論文進(jìn)行修改指正。