李 然，曹錦濤，閔 銳，孫 帥，馮振中，2，李 楠

（1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科/蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，安徽 蚌埠233030；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，安徽 合肥230000）

三陰型乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）以及人類表皮因子受體（Her2）均呈陰性表達(dá)的一類高度多樣化與異質(zhì)性的乳腺癌，占所有乳腺癌的15%～20%［1］。與其他類型乳腺癌相比，TNBC 患者的組織學(xué)與臨床分期呈現(xiàn)高度侵襲性特征［2］。治療方面，由于缺乏相應(yīng)激素受體，傳統(tǒng)的內(nèi)分泌及靶向治療效果不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高［3］。近年來，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lympho‐cytes，TIL）及腫瘤免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune check‐point blockade，ICB）療法逐漸引起關(guān)注。程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD1）是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的關(guān)鍵蛋白，研究表明PD1 高浸潤的T 細(xì)胞代表T 細(xì)胞耗竭更多、更具侵襲性的生物 學(xué) 特 征，以 及 抗PD1/PDL1 治 療 效 果 會 更 好［4］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）參與相關(guān)免疫抑制機(jī)制也有報(bào)道［5］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察TIL 及PD1 受體陽性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILPD1）在TNBC 中的表達(dá)及對預(yù)后的影響，探討PTEN/Twist1 在TNBC 中的表達(dá)，各蛋白之間是否存在關(guān)聯(lián)，對患者預(yù)后的作用，探究TNBC 腫瘤組織中PTEN 對于EMT 標(biāo)志蛋白Twist1 的影響與調(diào)控，進(jìn)而觀察PTEN/Twist1 對于下游TILPD1代表的T 細(xì)胞耗竭的調(diào)控，以期為TNBC 的相關(guān)免疫治療提供思路與幫助。

1 材料與方法

1.1 材料收集

收集2013～2018 年蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院診斷為乳腺癌患者標(biāo)本，包括TNBC 患者標(biāo)本76例，隨機(jī)抽取其他類型乳腺癌（NTNBC）標(biāo)本47 例。由兩名以上資深病理醫(yī)師閱片，根據(jù)最新版ASCO指南及AJCC 第八版指南進(jìn)行組織學(xué)與臨床的分級分期，并判斷乳腺癌患者的ER、PR、Her-2 以及PTEN、Twist1 與TILPD1 的表達(dá)程度。實(shí)驗(yàn)通過了蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守赫爾辛基宣言操作。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前未接受生物學(xué)治療、放化療等輔助治療手段；患者無其他惡性腫瘤及慢性病病史；患者確診為乳腺癌，并經(jīng)閱片復(fù)習(xí)有明確乳腺癌免疫組化分型；患者對實(shí)驗(yàn)知情同意，同意醫(yī)師定期隨訪。免疫組化結(jié)果若腫瘤組織不充分，存在非特異性染色則不納入。

1.2 腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）程度

通過蘇木素-伊紅（HE）染色切片，以腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞浸潤作為評估對象，低倍鏡下觀察淋巴細(xì)胞在間質(zhì)區(qū)域內(nèi)所占比例，并進(jìn)行分級。TILs 分級評 分 依 據(jù)2014 年 國 際TILs 工 作 小 組 建 議 判 定［6］，即：陰性：< 1% ；弱陽性：1%～20%；中等陽性：20%～50% ；強(qiáng)陽性：≥50%。

1.3 免疫組化

采取Envision 兩步法進(jìn)行免疫組化染色，一抗抗體來源見表1，二抗試劑、DAB 顯色劑等均購自福州邁新生物科技有限公司。免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤區(qū)域隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，以細(xì)胞內(nèi)定位區(qū)域出現(xiàn)棕黃染色為陽性。ER、PR 及Ki-67、Twist1 等核陽染色依據(jù)陽性細(xì)胞所占比例判斷（?：<1%；+ ：<25%；++：25%～70%；+++：>70% ）。PTEN 在腫瘤細(xì)胞中，以及PD1 在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILPD1）中呈現(xiàn)胞膜或胞漿陽性，以>1%定義為陽性，依據(jù)陽性細(xì)胞百分比判斷表達(dá)強(qiáng)度綜合計(jì)數(shù)分析［7］（陽性染色：淡黃色1 分；棕黃色2 分；黃褐色3 分。陽性細(xì)胞百分比：<1% 計(jì)0 分；< 5% 計(jì)1 分；25%～70% 計(jì)2 分；> 0% 計(jì)3 分。兩者相加，<1 分為?；1～2 分為+；3～4 分為++；>5 分為+++）。

表1 免疫組化抗體來源Tab 1 Sources of immunohistochemical antibodies

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)運(yùn)用SPSS 軟件26.0 版本，兩組間率的比較使用卡方檢驗(yàn)，多組檢驗(yàn)使用ANOVA 方差分析。單因素Kaplan-Meier 生存分析運(yùn)用Log Rank 檢驗(yàn)，運(yùn)用Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型進(jìn)行多因素生存分析；相關(guān)性分析使用Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)，運(yùn)用RStudio 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖制作，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNBC 及NTNBC 患者的臨床病理特征

TNBC 患者總生存期5～171 個(gè)月，隨訪過程中9 例患者死亡，12 例患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。相對于NTN‐BC 患者，TNBC 患者的發(fā)病年齡更輕，腫瘤直徑更大，且有更大的轉(zhuǎn)移傾向（P=0.012）、更高的組織學(xué)分級（P=0.048）、TNM 分期（P<0.01）（表2），以及更差的預(yù)后（P=0.014）（圖1）。

圖1 TNBC 與NTNBC 患者總生存期比較Fig 1 Cumulative survival rate comparison between TN?BC and NTNBC patients

表2 TNBC 及NTNBC 病例的臨床病理特征Tab 2 Clinicopathological characteristics of TNBC and NTNBC cases

2.2 TNBC 與NTNBC 組 織 中PTEN、Twist1、TILPD1 的表達(dá)

TNBC 患者PTEN 缺失表達(dá)（20.6%）與TIL‐PD1 陽性表達(dá)（85.5%）高于NTNBC，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。另外，TNBC 組中，Twist1 表達(dá)比例較高，淋巴細(xì)胞浸潤比例更高（92.9%）、程度更大，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2、表3）。

表3 TNBC 與NTNBC 組織中PTEN、Twist1、PD1 的表達(dá)Tab 3 Expression levels of PTEN，Twist1 and TILPD1 in TNBC and NTNBC tissues

2.3 TNBC 組織中PTEN、Twist1 與PD1 的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，TNBC 組織中PTEN 與Twist1 以及TILPD1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Twist1 與TILPD1 的表達(dá)呈正相關(guān)，檢驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4、圖3）。TILPD1 的表達(dá)與腫瘤間質(zhì)TIL 浸潤程度顯著正相關(guān)（表4）。PTEN 與腫瘤的臨床分期顯著負(fù)相關(guān)（表4），與TIL 浸潤程度、腫瘤轉(zhuǎn)移率、組織學(xué)分級也有一定的關(guān)聯(lián)性。

圖3 TNBC 組織中各因素的相關(guān)性熱圖Fig 3 Correlation heat map of various factors in TNBC tissues

表4 TNBC 組織中各因素的相關(guān)性分析Tab 4 Correlation analysis of various factors in TNBC tissues

2.4 TNBC 患者的單因素及多因素生存分析

以總生存期（overall survival，OS）為因變量，運(yùn)用Log rank 檢驗(yàn)分析，依據(jù)PTEN 蛋白有無表達(dá)、Twist1 及TILPD1 蛋白表達(dá)程度高低將病例各分為兩組，檢測各臨床病理因素及各因子對TNBC 患者生存時(shí)間的影響。Kaplan-Meier 分析顯示，較低的TNM 分級、無淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者臨床預(yù)后更好，而PTEN 缺失表達(dá)、TILPD1 高表達(dá)的患者預(yù)后不佳（表5）。利用多因素COX 回歸分析，運(yùn)用Omnibus 檢驗(yàn)建立模型，顯示PTEN 的缺失表達(dá)（圖4A、B）與TILPD1 高表達(dá)，患者預(yù)后不佳（圖4C、D），是影響TNBC 患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表6）。

表5 Kaplan-Meier 單因素生存分析Tab 5 Univariate Kaplan-Meier survival analysis of survival for TNBC patients

表6 COX 回歸多因素生存分析Tab 6 COX multivariate analysis of factors affecting survival of TNBC patients

圖4 TNBC 患者單因素及多因素分析生存曲線圖Fig 4 Survival curves of TNBC patients by univariate and multivariate Kaplan-Meier survival analysis

2.5 患者的臨床治療與預(yù)后

TNBC 患者術(shù)后治療：67 例接受了輔助化療，其中51 例（76.1%）患者使用了TAC 聯(lián)合化療方案（多西他賽+環(huán)磷酰胺+表柔比星），4 例患者聯(lián)合紫杉醇化療，2 例患者聯(lián)用鉑類藥物，另有聯(lián)合放療的患者4 例。隨訪顯示，22 例患者處于病情穩(wěn)定狀態(tài)（stable disease，SD），11 例患者疾病進(jìn)展（pro‐gressive disease，PD），僅有1 例患者完全緩解（com‐plete response，CR）。NTNBC 患者術(shù)后：共35 例患者接受了輔助化療，均使用TAC 方案，無患者接受聯(lián)合放療。其中3 例患者疾病進(jìn)展，其余患者病情穩(wěn)定。

3 討論

TNBC 是一類異質(zhì)性強(qiáng)、侵襲性強(qiáng)的乳腺癌，與其他類型乳腺癌相比，TNBC 在年輕女性中發(fā)病率高，遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率高，疾病特異性生存率較低，并伴隨著高級別的組織學(xué)類型與腦轉(zhuǎn)移高風(fēng)險(xiǎn)，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高［3］。此外，TNBC 有更強(qiáng)的免疫原性、更多的免疫活性及免疫途徑基因的富集和較高的淋巴細(xì)胞浸潤水平［8］。近年來，針對細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associat‐ed antigen-4，CTLA-4）、程序性死亡受體PD1 及其配體PDL1 的ICB 療法已被批準(zhǔn)用于治療多種癌癥，包括黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌等，并取得 一 定 成 效［9］。而TNBC 患 者 中 從PD1/PDL1 抑制劑治療中獲益的患者仍然有限［10］。因此，探究TNBC 腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)機(jī)制有益于提高ICB療法的特異性，有助于改善患者預(yù)后。

PD1 是一類I 型跨膜蛋白，主要表達(dá)于活化的T 細(xì)胞表面。PD1 分子能夠通過與其配體PDL1 結(jié)合，介導(dǎo)其對效應(yīng)T 細(xì)胞的抑制作用，從而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫功能［11］。T 細(xì)胞衰竭，即在腫瘤微環(huán)境的過度刺激下，T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和增殖的能力受損，并伴有免疫檢查點(diǎn)受體（如PD1、TIM3、和CTLA4 等）過度表達(dá)。TILPD1 一定程度上能夠作為T 細(xì)胞耗竭標(biāo)志物，表現(xiàn)為耗竭基因的顯著豐富，耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的偏態(tài)分布，相關(guān)免疫檢查點(diǎn)受體蛋白TIMS、CTLA4 的共表達(dá)，更具侵襲性的生物學(xué)特征，以及抗PD1/PDL1 治療的更好療效［4，12］。同時(shí)，Ren 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，間質(zhì)淋巴細(xì)胞中的PD1 表達(dá)比非腫瘤細(xì)胞中PDL1 的表達(dá)更能預(yù)測TNBC 患者的預(yù)后。PTEN是一種常見的抑癌基因，約有25%～30%的TNBC 病例會伴有PTEN 蛋白的缺失，該突變與TNBC 患者分子異質(zhì)性、耐藥性及化療后不良反應(yīng)密切相關(guān)，并伴有較差的抗PD1/PDL1 治 療 效 果［13］。Twist1 是 由Twist1基 因編碼的一類高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，并能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT 相關(guān)過程，增強(qiáng)腫瘤的侵襲性、遺傳不穩(wěn)定性，并參與PD1/PDL1 相關(guān)免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)［5］。

在腫瘤免疫微環(huán)境中，功能紊亂的T 細(xì)胞往往高表達(dá)PD1 蛋白［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，PTEN 的缺失與TILPD1 高表達(dá)是影響TNBC 患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示PD1 受體陽性腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞高表達(dá)可能作為預(yù)后不佳的預(yù)測指標(biāo)。與本研究一致，Meng 等［11］對PD1 降解機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，敲除連接蛋白FBXO38 不會影響微環(huán)境中T 細(xì)胞的發(fā)育與活化，T 細(xì)胞表面PD1 表達(dá)增高，導(dǎo)致小鼠腫瘤進(jìn)展增快。另外，有研究對218 例浸潤性乳腺癌患者的回顧性分析顯示，腫瘤浸潤PD1 陽性T 細(xì)胞與乳腺癌患者不良預(yù)后顯著相關(guān)［14］。

相關(guān)研究表明，多種機(jī)制參與PTEN基因?qū)NBC 的調(diào)控作用［15］。本研究結(jié)果顯示，PTEN 的缺失可作為TNBC 患者的預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能夠負(fù)向調(diào)控Twist1 與PD1 蛋白的表達(dá)，并與TIL的分布有一定的聯(lián)系。另外，PTEN 與腫瘤的臨床分期顯著負(fù)相關(guān)，與TIL 浸潤程度、腫瘤轉(zhuǎn)移率、組織學(xué)分級也有一定的關(guān)聯(lián)性，提示PTEN 作為負(fù)向調(diào)控分子，在TNBC 組織的腫瘤免疫微環(huán)境與EMT 相關(guān)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

另外，與其他類型乳腺癌相比，Twist1 在TN‐BC 組織中表達(dá)上調(diào)，與TILPD1 的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Twist1 相關(guān)EMT 調(diào)控機(jī)制在PTEN 對于TILPD1 的調(diào)節(jié)中起到一定的作用。與本研究的結(jié)果一致，Guestini 等［16］的研究也表明PTEN 的缺失表達(dá)是TNBC 患者新輔助化療（neoadjuvant chemo‐therapy，NAC）后不良反應(yīng)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。有學(xué)者前瞻性研究結(jié)果也顯示，在接受PDL1/PD1 抑制劑治療的患者中，轉(zhuǎn)移性TNBC 患者的腫瘤PTEN沉默突變分別與較高的組織學(xué)分期及較差的無病生存期（disease free survival，DFS）及OS 密切相關(guān)［13］。Ueno 等［17］認(rèn)為腫瘤組織中多種EMT 相關(guān)分子參與到腫瘤免疫微環(huán)境PD1/PDL1 蛋白表達(dá)調(diào)控之中。本研究結(jié)果一定程度上證實(shí)了PTEN及TILPD1 在TNBC 中的表達(dá)及對預(yù)后的影響，PTEN 表達(dá)對于TILPD1 及TIL 調(diào)控作用，以及相關(guān)免疫反應(yīng)與EMT 標(biāo)志蛋白Twist1 的相關(guān)性。

TNBC 患者中存在一定程度耐藥的情況。實(shí)驗(yàn)組67 例接受輔助治療的TNBC 患者中，處于SD狀 態(tài) 患 者22 例，PD 狀 態(tài)11 例，僅 有1 例 完 全 緩 解，化療反應(yīng)不佳的患者占比16.4%。目前，TNBC 患者的手術(shù)治療方式以根治性手術(shù)為主，但保乳手術(shù)的可行性也逐漸引起人們的重視［18］。臨床上尚無TNBC 患者特異敏感的化療及靶向藥物。部分TNBC 患者呈現(xiàn)雄激素受體（androgen receptor，AR）亞型，該類型對于雄激素治療敏感。PAPR 抑制劑奧拉帕尼、PD1 抑制劑、PI3K/AKT/mTOR 抑制劑在TNBC 中的作用也有所報(bào)道［19］。約40%的中晚期患者能夠從紫杉烷類藥物、蒽環(huán)霉素的聯(lián)合化療中獲得病理完全緩解（pathological complete re‐sponse，PCR），聯(lián)合應(yīng)用PD1/PDL1 單抗能顯著提高TNBC 患者的PCR 率［9］。

轉(zhuǎn)移性TNBC 患者對于抗PD1/PDL1 的應(yīng)答率較低，僅5%。在微環(huán)境PDL1 陽性的患者中，PD1/PDL1 阻 斷 劑 治 療 的 應(yīng) 答 率 增 高［10］。Meng等［11］的小鼠體內(nèi)外研究顯示，IL-2 能夠通過促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中FBXO38 的復(fù)表達(dá)，從而介導(dǎo)PD1 蛋白的泛素化降解，從蛋白水平上抑制抗腫瘤免疫。IL-2 與抗PD1 聯(lián)合治療或許是新的研究方向。有學(xué)者對于70 例TNBC 患者的前瞻臨床試驗(yàn)顯示短期阿霉素和順鉑的使用能夠誘導(dǎo)增加TNBC 患者對于PD1 阻斷劑的反應(yīng)，誘導(dǎo)更有利的腫瘤微環(huán)境，提高相關(guān)免疫基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［20］。同時(shí)，Schmid 的IMpassion130 臨床研究也顯示新輔助化療中紫杉醇與阿妥珠單抗連用可以有效改善PTEN 陰性PDL1陽性表達(dá)的轉(zhuǎn)移性TNBC 患者的生存預(yù)后［21］。

本研究探討了TNBC 中Twist1、PTEN、TIL‐PD1 蛋白的表達(dá)，并與對照組間比較，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)聯(lián)性。PTEN 缺失表達(dá)與TILPD1 的高表達(dá)是影響TNBC 患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。腫瘤微環(huán)境中TILPD1 水平受PTEN基 因 的 調(diào) 控，并 與EMT 相 關(guān) 蛋 白Twist1 存在著復(fù)雜平衡關(guān)系，相關(guān)機(jī)制有待于進(jìn)一步探索。本課題在蛋白水平上初步探討了TNBC 組織中PTEN 蛋白通過EMT 相關(guān)通路對于腫瘤微環(huán)境中T 細(xì)胞耗竭的調(diào)控，但是相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制，以及TILPD1 高表達(dá)的腫瘤組織與抗PD1/PDL1 聯(lián)合治療的相關(guān)性，尚有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)及臨床前瞻性研究進(jìn)一步探討。

作者貢獻(xiàn)度說明：

李然負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析、文章撰寫，李楠負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、文章審校，馮振中負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及指導(dǎo)，曹錦濤負(fù)責(zé)免疫組化實(shí)驗(yàn)及患者隨訪，閔銳負(fù)責(zé)免疫組化數(shù)據(jù)分析，孫帥負(fù)責(zé)蠟塊收集及免疫組化實(shí)驗(yàn)。