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        高效液相色譜法測定阿昔莫司中3種有關(guān)物質(zhì)的含量

        2021-07-03 06:38:04王向鋒黃小為田朋鑫郯城縣第一人民醫(yī)院山東臨沂7600臨沂市檢驗檢測中心山東臨沂76000
        中南藥學(xué) 2021年5期
        關(guān)鍵詞:吡嗪量瓶甲酸

        王向鋒,黃小為,田朋鑫(.郯城縣第一人民醫(yī)院,山東 臨沂 7600;.臨沂市檢驗檢測中心,山東 臨沂 76000)

        阿昔莫司(acipimox),化學(xué)名為5-甲基吡嗪-2-甲酸-4-氧化物,由美國輝瑞制藥公司開發(fā),于1985年首次在意大利上市[1],1988年被我國列入國家基本藥物品種目錄。阿昔莫司是煙酸衍生物,可降低低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油和載脂蛋白的水平,臨床用于治療高三酰甘油血癥和高膽固醇血癥[2-5]。阿昔莫司多采用5-甲基吡嗪-2-甲酸進行氧化制備[6-8],在氧化反應(yīng)的過程中,1位的氮同樣會發(fā)生氧化反應(yīng),從而生成副產(chǎn)物5-甲基吡嗪-2-甲酸-1-氧化物(雜質(zhì)Ⅰ)和5-甲基吡嗪-2-甲酸-1,4-二氧化物(雜質(zhì)Ⅱ)。其反應(yīng)路線如圖1所示。阿昔莫司的質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2020年版二部[9],在其質(zhì)量標準中僅將其起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸(雜質(zhì)Ⅲ)作為已知雜質(zhì),采用外標法進行測定,并未對其副產(chǎn)物雜質(zhì)進行控制。然而,兩種副產(chǎn)物雜質(zhì)在精制的過程中并不能完全除去,嚴重影響了阿昔莫司的純度。本文首次建立HPLC方法對阿昔莫司原料藥中3種雜質(zhì)進行測定,為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        圖1 阿昔莫司的合成路線及雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Synthetic route of acipimox and structure formula of impurities

        1 儀器與試藥

        Agilent1260型高效液相色譜儀,含二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱和二元泵(美國Agilent公司);Mettler XP205電子分析天平(瑞士Mettler公司)。

        阿昔莫司對照品(純度:99.9%,批號:100750-201702)、阿昔莫司雜質(zhì)Ⅲ對照品(純度:100%,批號:101360-201501)(中國食品藥品檢定研究院);阿昔莫司雜質(zhì)Ⅰ對照品(純度:99.7%,批號:D1912011)、阿昔莫司雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌罚兌龋?9.6%,批號:D1912021)(臨沂萊博醫(yī)藥公司);阿昔莫司原料藥(批號:AX200501、AX200502、AX200503,臨沂萊博醫(yī)藥公司);甲醇為色譜純;磷酸與四丁基氫氧化銨均為分析純;水為超純水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜條件

        色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);流動相:甲醇-0.01 mol·L-1四丁基氫氧化銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH 6.0)(7∶93);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:264 nm;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。

        2.2 溶液配制

        2.2.1 對照品儲備液 精密稱取阿昔莫司對照品52.33 mg、雜質(zhì)Ⅰ對照品51.20 mg、雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌?9.56 mg和雜質(zhì)Ⅲ對照品38.66 mg,分別置50 mL量瓶中,用流動相溶解,并稀釋至刻度,搖勻。

        2.2.2 混合對照品溶液 精密量取各對照品儲備液1 mL,置同一1000 mL量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻。

        2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗溶液 精密稱取阿昔莫司對照品約10 mg,置10 mL量瓶中,精密加入雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品儲備液各10 μL,用流動相溶解并稀釋至刻度,制成含阿昔莫司約1000 μg·mL-1,含雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ約1 μg·mL-1的溶液,作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。

        2.2.4 供試品溶液 精密稱取阿昔莫司約100 mg,置100 mL量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻。

        2.3 專屬性試驗

        取“2.2”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液、混合對照品溶液、供試品溶液與空白溶液(流動相),分別進樣測定,記錄色譜圖。各成分色譜峰的分離度均大于1.5,以阿昔莫司色譜峰計理論板數(shù)在5000以上。

        圖2 阿昔莫司HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of acipimox

        2.4 線性關(guān)系考察

        取“2.2”項下對照品儲備溶液10、50、100、500、1000 μL,置100 mL量瓶中,用流動相稀釋制成系列濃度混合對照品溶液,分別進樣,以質(zhì)量濃度C(μg·mL-1)為橫坐標,峰面積A為縱坐標,進行線性回歸,結(jié)果見表1。

        表1 3種成分回歸方程、LOD及LOQTab 1 Regression equation,LODs,and LOQs of 3 compounds

        2.5 定量限與檢測限

        取混合對照品溶液,用流動相逐步稀釋,按“2.1”項下色譜條件測定,分別以S/N=10、S/N=3求得雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的定量限(LOQ)和檢測限(LOD),結(jié)果見表1。

        2.6 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性

        按“2.2.2”項下方法制備混合對照品溶液,連續(xù)進樣6次,測定峰面積,結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面積的RSD分別為0.76%、0.82%和0.93%,表明儀器精密度良好。

        取同一供試品溶液(批號:AX200501),室溫放置,于0、2、6、12和24 h分別進樣測定,結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面積的RSD分別為0.86%、1.1%和0.84%。表明溶液在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

        取同批樣品(批號:AX200501),共6份,分別按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液,進樣測定,結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量的RSD分別為0.65%、0.52%和0.77%,表明重復(fù)性良好。

        2.7 回收試驗

        精密稱取已知雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ含量的樣品(批號:AX200501)約50 mg,共9份,置100 mL量瓶中,分別精密加入雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品儲備液10、20和30 μL,按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液,分別進樣測定,計算各有關(guān)物質(zhì)的回收率,結(jié)果見表2。

        表2 回收試驗Tab 2 Recovery

        2.8 耐用性試驗

        對方法耐用性進行試驗,分別考察了不同型號的色譜柱CAPCELL CORE C18(4.6 mm×100 mm,2.7 μm)和Shim-pack Velox C18(4.6 mm×150 mm,2.7 μm),通過改變色譜柱的柱溫(20℃、40℃及室溫)、流速(0.8 mL·min-1及1.2 mL·min-1)等試驗條件,考察各色譜峰分離情況,結(jié)果阿昔莫司峰與相鄰雜質(zhì)峰以及各雜質(zhì)峰之間均能達到基線分離。微調(diào)流動相中四丁基氫氧化銨溶液的濃度(0.009 mol·L-1和0.011 mol·L-1)和pH值(pH 5.9和pH 6.1)對耐用性進行考察,結(jié)果各色譜峰之間分離良好。表明本試驗方法的耐用性良好。

        2.9 樣品雜質(zhì)含量測定

        取3批阿昔莫司原料藥,按“2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。采用外標法分別計算雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量,結(jié)果見表3。

        表3 雜質(zhì)含量測定結(jié)果(%,n=2)Tab 3 Determination of impurity (%,n=2)

        3 討論

        3.1 色譜條件的選擇

        參考2020年版《中國藥典》二部阿昔莫司有關(guān)物質(zhì)檢查項色譜條件,選用甲醇-0.01 mol·L-1四丁基氫氧化銨溶液作為流動相,并對其比例進行優(yōu)化。當流動相比例為15∶85(藥典中流動相比例)時,雜質(zhì)Ⅰ峰與阿昔莫司峰不能完全分離,降低流動相中甲醇的比例,各成分色譜峰的分離度均有較大改善,且均能達到基線分離。

        本文采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱,該色譜柱為2.7 μm粒徑填料的核殼型色譜柱,由于表面多孔型填料具有極窄的粒徑分布和擴散路徑,同時可以減小渦流擴散,縮短傳質(zhì)路徑和減弱傳質(zhì)阻力,其柱效可獲得2 μm粒徑填料的色譜柱同等效果[10-11]。且此類型的色譜柱一般操作壓力在20 MPa左右,故可以在耐壓40 MPa的普通液相色譜系統(tǒng)上運行,使得在普通高效液相色譜儀實現(xiàn)超高效液相色譜的分析效率[12]。

        3.2 有關(guān)物質(zhì)分析

        阿昔莫司的起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸中吡嗪環(huán)的1位和4位氮元素具有相似的活性,在氧化反應(yīng)過程中,均有被氧化的概率,從而生成雜質(zhì)Ⅰ和Ⅱ。此兩種氧化物雜質(zhì)與5-甲基吡嗪-2-甲酸在結(jié)構(gòu)上與阿昔莫司相似,也具有相似的理化性質(zhì),在精制過程中不能完全去除。本文檢測結(jié)果表明,3種有關(guān)物質(zhì)均有不同程度的殘留,嚴重影響了阿昔莫司的純度,應(yīng)當建立檢測方法嚴格控制。

        3.3 小結(jié)

        本文建立HPLC方法對3種有關(guān)物質(zhì)的含量進行測定,結(jié)果顯示方法靈敏度高,重復(fù)性好,結(jié)果準確,可用于阿昔莫司原料藥中3種雜質(zhì)的測定,為阿昔莫司原料藥中有關(guān)物質(zhì)的檢查提供了依據(jù)。

        致謝:感謝臨沂萊博醫(yī)藥公司為本研究無償提供的雜質(zhì)對照品和阿昔莫司原料藥。

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