王向鋒，黃小為，田朋鑫（.郯城縣第一人民醫(yī)院，山東 臨沂 7600；.臨沂市檢驗檢測中心，山東 臨沂 76000）

阿昔莫司（acipimox），化學(xué)名為5-甲基吡嗪-2-甲酸-4-氧化物，由美國輝瑞制藥公司開發(fā)，于1985年首次在意大利上市[1]，1988年被我國列入國家基本藥物品種目錄。阿昔莫司是煙酸衍生物，可降低低密度脂蛋白膽固醇、三酰甘油和載脂蛋白的水平，臨床用于治療高三酰甘油血癥和高膽固醇血癥[2-5]。阿昔莫司多采用5-甲基吡嗪-2-甲酸進行氧化制備[6-8]，在氧化反應(yīng)的過程中，1位的氮同樣會發(fā)生氧化反應(yīng)，從而生成副產(chǎn)物5-甲基吡嗪-2-甲酸-1-氧化物（雜質(zhì)Ⅰ）和5-甲基吡嗪-2-甲酸-1，4-二氧化物（雜質(zhì)Ⅱ）。其反應(yīng)路線如圖1所示。阿昔莫司的質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2020年版二部[9]，在其質(zhì)量標準中僅將其起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸（雜質(zhì)Ⅲ）作為已知雜質(zhì)，采用外標法進行測定，并未對其副產(chǎn)物雜質(zhì)進行控制。然而，兩種副產(chǎn)物雜質(zhì)在精制的過程中并不能完全除去，嚴重影響了阿昔莫司的純度。本文首次建立HPLC方法對阿昔莫司原料藥中3種雜質(zhì)進行測定，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

圖1 阿昔莫司的合成路線及雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Synthetic route of acipimox and structure formula of impurities

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀，含二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱和二元泵（美國Agilent公司）；Mettler XP205電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

阿昔莫司對照品（純度：99.9%，批號：100750-201702）、阿昔莫司雜質(zhì)Ⅲ對照品（純度：100%，批號：101360-201501）（中國食品藥品檢定研究院）；阿昔莫司雜質(zhì)Ⅰ對照品（純度：99.7%，批號：D1912011）、阿昔莫司雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌罚兌龋?9.6%，批號：D1912021）（臨沂萊博醫(yī)藥公司）；阿昔莫司原料藥（批號：AX200501、AX200502、AX200503，臨沂萊博醫(yī)藥公司）；甲醇為色譜純；磷酸與四丁基氫氧化銨均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol·L－1四丁基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 6.0）（7∶93）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：264 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品儲備液 精密稱取阿昔莫司對照品52.33 mg、雜質(zhì)Ⅰ對照品51.20 mg、雜質(zhì)Ⅱ?qū)φ掌?9.56 mg和雜質(zhì)Ⅲ對照品38.66 mg，分別置50 mL量瓶中，用流動相溶解，并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 混合對照品溶液 精密量取各對照品儲備液1 mL，置同一1000 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 系統(tǒng)適用性試驗溶液 精密稱取阿昔莫司對照品約10 mg，置10 mL量瓶中，精密加入雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品儲備液各10 μL，用流動相溶解并稀釋至刻度，制成含阿昔莫司約1000 μg·mL－1，含雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ約1 μg·mL－1的溶液，作為系統(tǒng)適用性試驗溶液。

2.2.4 供試品溶液 精密稱取阿昔莫司約100 mg，置100 mL量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.3 專屬性試驗

取“2.2”項下系統(tǒng)適用性試驗溶液、混合對照品溶液、供試品溶液與空白溶液（流動相），分別進樣測定，記錄色譜圖。各成分色譜峰的分離度均大于1.5，以阿昔莫司色譜峰計理論板數(shù)在5000以上。

圖2 阿昔莫司HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of acipimox

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2”項下對照品儲備溶液10、50、100、500、1000 μL，置100 mL量瓶中，用流動相稀釋制成系列濃度混合對照品溶液，分別進樣，以質(zhì)量濃度C（μg·mL－1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 3種成分回歸方程、LOD及LOQTab 1 Regression equation，LODs，and LOQs of 3 compounds

2.5 定量限與檢測限

取混合對照品溶液，用流動相逐步稀釋，按“2.1”項下色譜條件測定，分別以S/N＝10、S/N＝3求得雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的定量限（LOQ）和檢測限（LOD），結(jié)果見表1。

2.6 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性

按“2.2.2”項下方法制備混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面積的RSD分別為0.76%、0.82%和0.93%，表明儀器精密度良好。

取同一供試品溶液（批號：AX200501），室溫放置，于0、2、6、12和24 h分別進樣測定，結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ峰面積的RSD分別為0.86%、1.1%和0.84%。表明溶液在室溫條件下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

取同批樣品（批號：AX200501），共6份，分別按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量的RSD分別為0.65%、0.52%和0.77%，表明重復(fù)性良好。

2.7 回收試驗

精密稱取已知雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ含量的樣品（批號：AX200501）約50 mg，共9份，置100 mL量瓶中，分別精密加入雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ對照品儲備液10、20和30 μL，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定，計算各有關(guān)物質(zhì)的回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收試驗Tab 2 Recovery

2.8 耐用性試驗

對方法耐用性進行試驗，分別考察了不同型號的色譜柱CAPCELL CORE C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Shim-pack Velox C18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），通過改變色譜柱的柱溫（20℃、40℃及室溫）、流速（0.8 mL·min－1及1.2 mL·min－1）等試驗條件，考察各色譜峰分離情況，結(jié)果阿昔莫司峰與相鄰雜質(zhì)峰以及各雜質(zhì)峰之間均能達到基線分離。微調(diào)流動相中四丁基氫氧化銨溶液的濃度（0.009 mol·L－1和0.011 mol·L－1）和pH值（pH 5.9和pH 6.1）對耐用性進行考察，結(jié)果各色譜峰之間分離良好。表明本試驗方法的耐用性良好。

2.9 樣品雜質(zhì)含量測定

取3批阿昔莫司原料藥，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。采用外標法分別計算雜質(zhì)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的含量，結(jié)果見表3。

表3 雜質(zhì)含量測定結(jié)果(%，n＝2)Tab 3 Determination of impurity (%，n＝2)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

參考2020年版《中國藥典》二部阿昔莫司有關(guān)物質(zhì)檢查項色譜條件，選用甲醇-0.01 mol·L－1四丁基氫氧化銨溶液作為流動相，并對其比例進行優(yōu)化。當流動相比例為15∶85（藥典中流動相比例）時，雜質(zhì)Ⅰ峰與阿昔莫司峰不能完全分離，降低流動相中甲醇的比例，各成分色譜峰的分離度均有較大改善，且均能達到基線分離。

本文采用Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱，該色譜柱為2.7 μm粒徑填料的核殼型色譜柱，由于表面多孔型填料具有極窄的粒徑分布和擴散路徑，同時可以減小渦流擴散，縮短傳質(zhì)路徑和減弱傳質(zhì)阻力，其柱效可獲得2 μm粒徑填料的色譜柱同等效果[10-11]。且此類型的色譜柱一般操作壓力在20 MPa左右，故可以在耐壓40 MPa的普通液相色譜系統(tǒng)上運行，使得在普通高效液相色譜儀實現(xiàn)超高效液相色譜的分析效率[12]。

3.2 有關(guān)物質(zhì)分析

阿昔莫司的起始原料5-甲基吡嗪-2-甲酸中吡嗪環(huán)的1位和4位氮元素具有相似的活性，在氧化反應(yīng)過程中，均有被氧化的概率，從而生成雜質(zhì)Ⅰ和Ⅱ。此兩種氧化物雜質(zhì)與5-甲基吡嗪-2-甲酸在結(jié)構(gòu)上與阿昔莫司相似，也具有相似的理化性質(zhì)，在精制過程中不能完全去除。本文檢測結(jié)果表明，3種有關(guān)物質(zhì)均有不同程度的殘留，嚴重影響了阿昔莫司的純度，應(yīng)當建立檢測方法嚴格控制。

3.3 小結(jié)

本文建立HPLC方法對3種有關(guān)物質(zhì)的含量進行測定，結(jié)果顯示方法靈敏度高，重復(fù)性好，結(jié)果準確，可用于阿昔莫司原料藥中3種雜質(zhì)的測定，為阿昔莫司原料藥中有關(guān)物質(zhì)的檢查提供了依據(jù)。

致謝：感謝臨沂萊博醫(yī)藥公司為本研究無償提供的雜質(zhì)對照品和阿昔莫司原料藥。