王軍，邱榮英，李鐵健，張貴民*（1.山東新時代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400；2.國家手性制藥工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 273400；3.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276005）

鹽酸阿呋唑嗪，化學名為N-{3-[（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）甲基氨基]丙基}-2-四氫呋喃甲酰胺鹽酸鹽，是一種喹唑啉衍生物，屬α1腎上腺素能受體拮抗劑，其化學結(jié)構(gòu)見圖1。該藥物能高選擇性地與前列腺的α1-受體競爭性結(jié)合，影響α1受體介導的平滑肌收縮，減輕良性前列腺增生患者的排尿障礙[1]，有效改善尿頻、尿急、排尿困難等臨床癥狀[2]，對輸尿管結(jié)石也有一定療效[3]。該藥物由賽諾菲-圣德拉堡公司研發(fā)，于1988年在法國首次上市，其緩釋片劑于2003年在美國上市，2004年底在中國上市[4]。

圖1 鹽酸阿呋唑嗪結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structure of alfuzosin hydrochloride

目前國內(nèi)外對鹽酸阿呋唑嗪的研究主要集中在合成[1，4-7]、制劑[8-11]與藥物動力學方面[12-16]，分析方法主要包括液相色譜法[10，14-15，17-19]與高效薄層色譜法[20]，利用高效液相色譜-質(zhì)譜（LCMS/MS）法對其雜質(zhì)研究未見報道。隨著公眾與媒體對藥物安全性的日益關(guān)注，對藥物中的雜質(zhì)控制已成為藥品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)，開展雜質(zhì)研究不僅能定性雜質(zhì)，還能提示工藝改進。本文采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）法首次對鹽酸阿呋唑嗪中的雜質(zhì)進行了定性分析，為下一步工藝優(yōu)化與質(zhì)量研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜、G6540B四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀（美國Agilent公司），配有電噴霧離子源（ESI）以及MassHunter B.06.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。鹽酸阿呋唑嗪（企業(yè)A）；乙腈（色譜純，美國Merck公司）；乙酸銨（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；實驗用水為自制超純水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱Thermo Hypersil gold aq C18柱（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：A相為10 mmol·L－1乙酸銨水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫（洗脫程序為：0～3 min，10%B；3～10 min，10%～95%B；10～11 min，95%～10%B；11～15 min，10%B）。柱溫為40℃；波長為245 nm；流速為0.3 mL·min－1；進樣量為 2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描范圍m/z50～800；霧化氣溫度：300℃；毛細管電壓4 kV，干燥氣流速10 L·min－1；裂解電壓60 V；錐孔電壓45 V；碰撞能量：30 eV。

2.3 供試品溶液的配制

稱取鹽酸阿呋唑嗪樣品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋定容，取適量過0.2 μm濾膜，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的優(yōu)化

目前歐洲藥典9.6版檢測鹽酸阿呋唑嗪的方法為高氯酸溶液與乙腈用梯度洗脫進行分析[21]，由于高氯酸為無機酸，無法直接進入質(zhì)譜進行樣品分析，因此需要轉(zhuǎn)換為揮發(fā)性流動相進行分析。經(jīng)過優(yōu)化最終采用乙酸銨水溶液與乙腈進行梯度洗脫，優(yōu)化梯度洗脫條件后，各雜質(zhì)均具有較好的質(zhì)譜響應值，有利于下一步雜質(zhì)的定性分析。

鹽酸阿呋唑嗪的分子量小于800 Da，由于雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與其相似，最終選定了質(zhì)譜采集范圍為m/z50～800。在質(zhì)譜中獲得雜質(zhì)的一級譜圖后，分別對各母離子優(yōu)化碰撞能量，最終確定為30 eV。在最終確定的測定條件下獲得各雜質(zhì)的二級質(zhì)譜碎片離子，并據(jù)此對各雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)進行推導。

3.2 供試品溶液UPLC圖譜

供試品溶液的UPLC圖見圖2，按照出峰時間依次對雜質(zhì)編號1～6。鹽酸阿呋唑嗪在溶液中解離，因此在UPLC圖中主峰為阿呋唑嗪。雜質(zhì)4與雜質(zhì)5雖然未能達到基線分離，但是不影響定性分析。

圖2 阿呋唑嗪供試品溶液的UPLC圖譜Fig 2 UPLC chromatogram of alfuzosin

3.3 阿呋唑嗪質(zhì)譜信息

樣品主成分阿呋唑嗪的二級質(zhì)譜圖見圖3。母離子峰m/z390.2149 [M＋H]＋，其碎裂途徑如圖4所示：由圖中A示線斷裂后，按照途徑a進行碎裂，首先生成碎片m/z275.1505，元素組成為C14H19N4O2＋，該碎片脫去亞乙基生成m/z247.119，繼續(xù)失CH2后生成m/z235.1192，繼續(xù)失CH2后繼續(xù)丟失兩個H生成m/z219.0877；由圖中B示線斷裂后，失去B線右側(cè)C11H13N4O2基團，按照途徑b生成碎片m/z156.1019，進一步丟失C4H7NO，生成m/z71.0495。

圖3 阿呋唑嗪的二級質(zhì)譜圖Fig 3 MS2 spectrum of alfuzosin

圖4 阿呋唑嗪的裂解途徑Fig 4 Fragmentation pathway of alfuzosin

3.4 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析

3.4.1 雜質(zhì)質(zhì)譜信息 6個雜質(zhì)經(jīng)過UPLC-QTOF-MS分析后，獲得精確分子量與二級質(zhì)譜碎片。通過精確分子量利用MassHunter軟件計算出分子式，各精確分子量與理論值的誤差均小于5×10－6，結(jié)合二級質(zhì)譜碎片推導各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，具體信息見表1。

表1 鹽酸阿呋唑嗪中雜質(zhì)的質(zhì)譜信息Tab 1 MS information of impurities in alfuzosin hydrochloride

3.4.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析 在原料藥的生產(chǎn)過程中，雜質(zhì)與原料藥在結(jié)構(gòu)上較相近，因此可以通過對比原料藥的質(zhì)譜碎裂特征鑒定雜質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)[23]。本文結(jié)合阿呋唑嗪的裂解規(guī)律與雜質(zhì)的碎片離子對各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)解析如下。

雜質(zhì)1：二級質(zhì)譜圖見圖5，母離子m/z292.1771 [M＋H]＋，經(jīng)過軟件計算分子式C14H21N5O2。由于存在碎 片m/z275.1508，m/z247.1196，m/z219.0879，其形成機制參考阿呋唑嗪的a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結(jié)構(gòu)（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0826由m/z247.1196失去一個甲氧基與兩個甲基生成；碎片m/z259.1194為m/z275.1508失去CH2后，繼續(xù)丟失兩個H形成的。由此判斷雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖6所示。

圖5 雜質(zhì)1的MS2質(zhì)譜圖Fig 5 MS2 spectrum of impurity 1

圖6 雜質(zhì)1可能的裂解途徑圖Fig 6 Proposed fragmentation pathway of impurity 1

雜質(zhì)2：二級質(zhì)譜圖見圖7，母離子m/z488.2521 [M＋H]＋，經(jīng)過軟件計算分子式為C24H33N5O6，比阿呋唑嗪多了C5H6O2，初步判斷該基團為2-甲酰基四氫呋喃，雜質(zhì)母離子丟失該基團后生成碎片m/z390.2149，同阿呋唑嗪母離子結(jié)構(gòu)，碎片m/z275.1504，m/z235.1193，m/z156.1021，m/z71.0496形成機制參考阿呋唑嗪碎裂機制；碎片m/z333.1567為母離子丟失兩個四氫呋喃環(huán)后，再失去氨基生成。由此可判斷雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)與可能的裂解機制如圖8所示。

圖7 雜質(zhì)2的MS2質(zhì)譜圖Fig 7 MS2 spectrum of impurity 2

圖8 雜質(zhì)2可能的裂解途徑圖Fig 8 Proposed fragmentation pathway of impurity 2

雜質(zhì)3：二級質(zhì)譜圖見圖9，母離子m/z235.1192 [M＋H]＋，經(jīng)過軟件計算分子式C11H14N4O2，由于該母離子峰與阿呋唑嗪二級碎片m/z235.1192相同，初步推斷二者為同一結(jié)構(gòu)；其中碎片m/z219.0883形成機制參考阿呋唑嗪a途徑碎裂機制；碎片m/z191.0927由母離子m/z235.1192失去一個甲氧基與一個甲基生成。由此判斷雜質(zhì)3的結(jié)構(gòu)與可能的斷裂機制如圖10所示。

圖9 雜質(zhì)3的MS2質(zhì)譜圖Fig 9 MS2 spectrum of impurity 3

圖10 雜質(zhì)3可能的裂解途徑圖Fig 10 Proposed fragmentation pathway of impurity 3

雜質(zhì)4：二級質(zhì)譜圖見圖11，母離子m/z320.1726 [M＋H]＋，經(jīng)過軟件計算分子式為C15H21N5O3，由于存在碎片離子m/z275.1504，m/z247.1194，m/z235.1193，m/z219.088，其形成機制參考阿呋唑嗪的a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結(jié)構(gòu)（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0905由m/z235.1193失去一個甲氧基與一個甲基生成。碎片m/z86.0604經(jīng)過軟件計算元素組成為C4H8NO＋，該碎片失去亞乙基后生成碎片m/z58.0292。由上可以推斷雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)與可能的裂解機制如圖12所示。

圖11 雜質(zhì)4的MS2質(zhì)譜圖Fig 11 MS2 spectrum of impurity 4

圖12 雜質(zhì)4可能的裂解途徑圖Fig 12 Proposed fragmentation pathway of impurity 4

雜質(zhì)5二級質(zhì)譜圖見圖13，二級母離子m/z288.1454 [M＋H]＋，經(jīng)過軟件計算分子式C14H17N5O2，由于存在碎片m/z247.1188，m/z219.0885，其形成機制參考阿呋唑嗪的a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結(jié)構(gòu)（即C14H19N4O2）；碎片m/z191.0823形成機制參考雜質(zhì)1裂解過程；碎片m/z272.1139為母離子丟失一個甲基形成的。由此判斷雜質(zhì)5結(jié)構(gòu)與可能的二級斷裂機制如圖14所示。

圖13 雜質(zhì)5的MS2質(zhì)譜圖Fig 13 MS2 spectrum of impurity 5

圖14 雜質(zhì)5可能的裂解途徑圖Fig 14 Proposed fragmentation pathway of impurity 5

雜質(zhì)6二級質(zhì)譜圖見圖15，母離子m/z364.1979 [M＋H]＋，經(jīng)過軟件計算分子式為C17H25N5O4，碎片m/z318.1564為母離子失去C2H5O生成。碎片離子m/z275.1501、m/z247.1187、m/z235.1188、m/z219.0876形成機制參考鹽酸阿呋唑嗪a裂解途徑，說明含有阿呋唑嗪部分結(jié)構(gòu)（即C14H19N4O2）；雜質(zhì)母離子失去C11H13N4O2基團形成碎片m/z130.0859，結(jié)合鹽酸阿呋唑嗪b裂解機制可以判斷出C11H13N4O2基團結(jié)構(gòu)；碎片m/z130.0859失去乙基生成碎片m/z102.055，繼續(xù)失去CH2生成碎片m/z74.0239。由此可判斷雜質(zhì)6結(jié)構(gòu)與可能的裂解機制如圖16所示。

圖15 雜質(zhì)6的MS2質(zhì)譜圖Fig 15 MS2 spectrum of impurity 6

圖16 雜質(zhì)6可能的裂解途徑圖Fig 16 Proposed fragmentation pathway of impurity 6

3.4.3 雜質(zhì)來源推測 根據(jù)表1中解析的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻報道工藝路線[4]，對各雜質(zhì)來源分析如下：雜質(zhì)1為合成路線里的中間體，推斷為該物料未反應完全，帶入了鹽酸阿呋唑嗪中。目前歐洲藥典9.6版收載了阿呋唑嗪7個雜質(zhì)，分別為雜質(zhì)A～G[21]，雜質(zhì)1與歐洲藥典中的雜質(zhì)D結(jié)構(gòu)一致，化學名為N-甲基-N-（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）-1，3-丙二胺；雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)中含有兩個甲?；臍溥秽鶊F，推測為一分子的雜質(zhì)1與兩分子的2-四氫呋喃甲酸反應生成；雜質(zhì)3為甲胺與2-氯-4-氨基-6，7-二甲氧基喹唑啉反應形成；雜質(zhì)4推測為雜質(zhì)1與甲酸反應生成，該雜質(zhì)與歐洲藥典中的雜質(zhì)E結(jié)構(gòu)一致，化學名為N-{3-[（4-氨基-6，7-二甲氧基）甲氨基]丙基}甲酰胺。雜質(zhì)5為合成路線里的中間體，化學名為3-[N-（4-氨基-6，7-二甲氧基-2-喹唑啉基）-N-甲基氨基]丙腈，該物料未反應完全，帶入了鹽酸阿呋唑嗪中；雜質(zhì)6為雜質(zhì)1與氯甲酸乙酯反應生成。

4 小結(jié)

LC-Q-TOF-MS有利于研究化合物質(zhì)譜裂解規(guī)律，通過比較藥物主成分與有關(guān)物質(zhì)的多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)的異同，可快速推斷有關(guān)物質(zhì)發(fā)生的變化，為最終確定雜質(zhì)結(jié)構(gòu)提供可靠信息[22]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS法對鹽酸阿呋唑嗪中的6個雜質(zhì)進行了定性研究。通過鹽酸阿呋唑嗪的二級質(zhì)譜特征碎片離子，推導了6個雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，結(jié)合其結(jié)構(gòu)推測雜質(zhì)為合成過程中產(chǎn)生，需優(yōu)化工藝路線，增加過程監(jiān)控，減少甚至避免雜質(zhì)的產(chǎn)生。本文可為鹽酸阿呋唑嗪的工藝優(yōu)化與質(zhì)量控制提供參考。