田其健，包旭宏，姜墾，朱建英（.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，蘭州 730000；.甘肅奇正藏藥有限公司，蘭州 730000）

洋丁香（Syringa vulgarisL.）為木犀科丁香屬植物洋丁香的干燥葉片，又稱“歐丁香”，為中藥丁香葉藥材來源之一。洋丁香原產(chǎn)東南歐，在我國分布廣泛，東北、華北、西北各省及江蘇等地均有種植，具有觀賞、環(huán)境美化和藥用等多種用途，是庭院綠化的主要樹種之一。其性寒、味苦，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消炎止痢、保肝利膽等功效。民間用其水煎液治療痢疾和暴發(fā)火眼，外敷皮膚用于止癢。現(xiàn)代研究表明，洋丁香所含化學(xué)成分主要有倍半萜類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、三萜類、黃酮類、苯丙素類、苯乙醇類等。其中紫丁香苷具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛[1-4]等作用，酪醇具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)和心血管等作用[5-8]。

凝膠劑是一種藥物與適當(dāng)基質(zhì)制成的具有凝膠特性的稠厚液體或半固體制劑。將傳統(tǒng)中藥制劑處方和凝膠劑制備技術(shù)相結(jié)合所制備的中藥凝膠劑不僅可以容納中藥提取物，也可以容納中藥材極細(xì)粉，具有工藝簡單、使用方便、易于清洗等優(yōu)點(diǎn)，是一種良好的藥用劑型，具有廣闊的發(fā)展前景[9]。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面與正交試驗(yàn)法優(yōu)選洋丁香的提取及其凝膠劑的制備工藝，以期為洋丁香的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

數(shù)顯恒溫電熱套（SKM，菏澤市博奧儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-3，瑞士步琦有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHZ-95B，上海予華儀器設(shè)備有限公司）；低溫冷卻液循環(huán)泵（DLSB-5/20，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；立式超純水機(jī)（MOLgene120d，甘肅摩勒科學(xué)有限公司）；超聲波清洗儀（BK8200HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；電子天平（YP-2001N，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；分析天平[XS205DU，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101A-3B，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；高效液相色譜儀[Agilent 1260，安捷倫科技（中國）有限公司]；電動攪拌器（R-30，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試藥

紫丁香苷對照品（批號：111574-201605，純度：95.2%）、酪醇對照品（批號：111676-200602，純度≥98.0%）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（成都科隆化學(xué)品有限公司）；卡波姆940（河北固安希星藥業(yè)有限公司）；丙二醇（湖南爾康制藥股份有限公司）；丙三醇（天津河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）；三乙醇胺（天津百世化工有限公司）；純水為自制。洋丁香葉摘自蘭州市城關(guān)區(qū)南河道，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為洋丁香。洋丁香葉片篩去雜質(zhì)，洗凈后曬干，陰涼通風(fēng)處保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材吸水率測定

稱取洋丁香藥材5 g，加足量水浸泡，每隔10 min觀察藥材是否浸透，稱重，計(jì)算吸水率。吸水率（%）＝（藥材濕重－5）/5×100%。吸水率曲線見圖1。由圖1可知，藥材40 min時(shí)幾乎吸水完全，此時(shí)吸水率為324.60%，約為自身重量3倍。因此后續(xù)煎煮時(shí)加水量應(yīng)減為第1次加水量的1/3。

圖1 藥材吸水率曲線Fig 1 Water absorption curve

2.2 出膏率測定

取洋丁香藥材30 g，加水適量，經(jīng)回流提取獲得水煎液，減壓濃縮至50 mL取10 mL于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后于105℃干燥至恒重。干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率。出膏率（%）＝（含干膏蒸發(fā)皿質(zhì)量－蒸發(fā)皿質(zhì)量）×5/30×100%。

2.3 紫丁香苷、酪醇含量測定

2.3.1 對照品溶液的配制 精密稱取紫丁香苷對照品8.3 mg、酪醇對照品10.7 mg分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲處理10 min，作為紫丁香苷、酪醇對照品儲備液。精密量取紫丁香苷、酪醇對照品儲備液0.5、1、2、4、6 mL于10 mL量瓶中，定容，制成分別含紫丁香苷15.8、31.6、63.2、126.4、189.6 μg·mL－1紫丁香苷對照品（經(jīng)折算后）與分別含酪醇21.42、42.84、85.68、171.36、257.04 μg·mL－1的酪醇對照品溶液，4℃儲藏，備用。

2.3.2 色譜條件

① 紫丁香苷：色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B）（18∶82）；流速為1.0 mL·min－1；柱溫為25℃；檢測波長為265 nm；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

② 酪醇：色譜柱為Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸水（B）（15∶85）；流速為1.0 mL·min－1；柱溫為25℃，檢測波長為275 nm；進(jìn)樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按酪醇峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。

2.3.3 供試品溶液的制備

① 紫丁香苷：取洋丁香藥材30 g于500 mL圓底燒瓶中，精密加入300 mL水，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，減壓濃縮至50 mL，精密量取1 mL，10%乙醇稀釋2倍，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

② 酪醇：取上述濃縮液1 mL于5 mL量瓶中定容，2倍量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，水浴揮干，2 mL甲醇溶解，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液進(jìn)樣測定，以色譜峰面積對進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得紫丁香苷回歸方程：y＝21.98x＋13.30，R2＝0.9999，線性范圍為15.8～189.6 μg·mL－1；得到酪醇回歸方程：y＝6.33x－3.85，R2＝1.000，線性范圍為21.42～257.04 μg·mL－1。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下126.4 μg·mL－1的紫丁香苷與171.36 μg·mL－1的酪醇對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。分別計(jì)算紫丁香苷、酪醇峰面積的RSD，結(jié)果分別為0.69%與0.56%。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密稱取“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后進(jìn)樣分析。結(jié)果紫丁香苷、酪醇峰面積的RSD分別為1.1%和1.5%。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測定。結(jié)果紫丁香苷與酪醇峰面積的RSD分別為0.92%和0.31%。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的供試品溶液3份，分別加入紫丁香苷、酪醇對照品適量，進(jìn)樣分析，計(jì)算得供試品在低、中、高濃度下紫丁香苷的平均回收率分別為98.72%、96.37%與99.71%，RSD值分別為2.4%、1.3%與2.1%；酪醇平均回收率分別為102.06%、101.75%與98.87%，RSD值分別為4.1%、3.3%與2.7%（n＝3）。

2.4 提取工藝考察因素與評分方法

洋丁香民間常水煎后使用，因此對其水提工藝進(jìn)行考察。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以出膏率、紫丁香苷和酪醇提取含量為指標(biāo)綜合評分，選擇加液倍數(shù)、提取次數(shù)和提取時(shí)間為考察因素。采用層次分析法（AHP）進(jìn)行分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道與專家意見[10-11]，確定各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，判斷矩陣見表1。

表1 各指標(biāo)權(quán)重的判斷矩陣Tab 1 Judgment matrix

采用AHP計(jì)算，最終確定出膏率、紫丁香苷、酪醇的權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.3和0.3。根據(jù)權(quán)重系數(shù)計(jì)算綜合評分Y（%）＝出膏率/出膏率最大值×0.4＋紫丁香苷含量/紫丁香苷含量最大值×0.3＋酪醇含量/酪醇含量達(dá)最大值×0.3。

2.5 單因素考察洋丁香提取工藝

稱取藥材30 g，固定其他條件不變，分別考察加液倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)、浸泡時(shí)間對洋丁香提取工藝的影響，結(jié)果見圖2，考慮實(shí)際操作，選擇加液10倍、每次提取1.5 h、提取2次作為響應(yīng)面法的考察水平。

圖2 洋丁香HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of syringa vulgaris L.

圖3 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig 3 Single factor test

2.6 洋丁香提取工藝的優(yōu)選

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇提取時(shí)間、加液倍數(shù)與提取次數(shù)為考察因素。因素與水平見表2。以出膏率與紫丁香苷、酪醇含量為考察指標(biāo)，按照Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)見表3、圖4，方差分析結(jié)果見表4。

圖4 3種因素對綜合評分的響應(yīng)面圖Fig 4 Response surface plot of 3 factors on comprehensive scoring

表2 因素水平表Tab 2 Factor and level

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 3 Design and results

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Variance analysis

由表4可知，失擬項(xiàng)P值＞0.05表明該模型擬合度較好，可信度較高，可用該模型優(yōu)化制備工藝。

采用Design-expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到綜合評分（Y）對提取時(shí)間（A）、提取次數(shù)（B）、加液倍數(shù)（C）的回歸方程為Y＝－151.45＋39.41A＋61.60B＋24.71C＋0.28AB＋1.10AC－0.91BC－16.39A2－10.10B2－1.18C2。由表可知各項(xiàng)影響因素對模型的影響程度為提取次數(shù)＞加液倍數(shù)＞提取時(shí)間，通過對回歸模型的極值分析可以得到最優(yōu)條件為提取1.57 h，提取2.61次，加液10.17倍，此時(shí)Y的預(yù)測值為85.52%。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際操作，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為加液10倍，提取2次，每次1.5 h。

根據(jù)上述優(yōu)化的提取工藝參數(shù)分別提取3份藥材，結(jié)果顯示3份藥材Y平均值為82.62%，（RSD＝1.5%，n＝3），與預(yù)測值81.54%相對誤差為0.51%，說明該模型預(yù)測性擬合度良好，所得數(shù)據(jù)可靠。

2.7 凝膠劑的制備

2.7.1 基質(zhì)篩選 本試驗(yàn)主藥為洋丁香水提取物，結(jié)合文獻(xiàn)[10-14]，選擇卡波姆940為凝膠劑基質(zhì)，甘油和丙二醇為常用保濕劑，三乙醇胺為pH調(diào)節(jié)劑，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以凝膠劑的外觀性狀、涂展性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性和離心穩(wěn)定性的綜合評分為指標(biāo)篩選洋丁香凝膠劑中各輔料的最佳用量。

2.7.2 有效成分的提取 照上述篩選的最佳提取工藝稱取洋丁香藥材30 g，在圓底燒瓶中加入300 mL水，回流提取2次，每次1.5 h，合并水煎液并濃縮至30 mL（密度約為1.0），冷卻，放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.3 凝膠劑的制備 稱取處方量的凝膠劑基質(zhì)均勻撒在適量蒸餾水的表面，靜置溶脹過夜。將甘油、丙二醇加入中藥中攪拌均勻后將其加入凝膠劑基質(zhì)中混勻。加入處方量三乙醇胺，加蒸餾水至100 g，400 r·min－1攪拌均勻即可。

2.7.4 質(zhì)量檢查 對凝膠劑進(jìn)行外觀性狀、涂展性、耐熱[9]、耐寒和離心穩(wěn)定性檢查，并對其進(jìn)行打分評價(jià)。滿分為10分，評分標(biāo)準(zhǔn)如表5所示。

表5 評分標(biāo)準(zhǔn)Tab 5 Standard for evaluation

2.7.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期試驗(yàn)制訂因素水平見表6。

表6 因素水平表Tab 6 Factor and level

2.7.6 試驗(yàn)結(jié)果 按照正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。按照表5設(shè)定的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果見表7。方差分析結(jié)果見表8。由表8可以看出，各因素影響順序?yàn)榭ú?40＞三乙醇胺＞甘油＞丙二醇，結(jié)合實(shí)際情況，綜合考慮選擇工藝為每100 g凝膠劑中卡波姆940為1.5%，丙二醇10%，甘油5%，三乙醇胺1.5%。凝膠劑成型效果見圖5。

圖5 凝膠劑產(chǎn)品圖Fig 5 Product drawing of gel

表7 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab 7 Design and results of trials

表8 方差分析結(jié)果Tab 8 Variance analysis

按照處方最佳組合制備3批凝膠劑，結(jié)果制備的凝膠劑外觀細(xì)膩均勻，涂展性與穩(wěn)定性良好，平均評分為9.2分，見表9。

表9 處方驗(yàn)證評分(分)Tab 9 Prescription verification score (score)

3 討論

本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法對洋丁香傳統(tǒng)提取方式進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出最佳水提條件，可為其后續(xù)制劑生產(chǎn)提供參考。

洋丁香入藥具有清熱解毒、抗菌消炎等功效，民間常用其水煎液內(nèi)服治療細(xì)菌性痢疾，熱敷外用于皮膚瘙癢等癥。研究發(fā)現(xiàn)洋丁香葉中含有的環(huán)烯醚萜類、黃酮類成分具有一定的抗炎、抗菌藥理活性[15]。凝膠劑制法簡單，使用方便、舒適，能夠較長時(shí)間黏附于作用部位，因此本試驗(yàn)將洋丁香提取物制備成中藥凝膠制劑以便于皮膚外用。凝膠劑的基質(zhì)常分為水性與油性，結(jié)合提取物性質(zhì)，本試驗(yàn)選擇了水性基質(zhì)為藥物載體。通過正交試驗(yàn)對卡波姆940、丙二醇、甘油與三乙醇胺進(jìn)行處方篩選，最優(yōu)處方制得的中藥凝膠劑外觀性狀、涂展性和穩(wěn)定性表現(xiàn)良好，其工藝操作簡單，穩(wěn)定可行。后期試驗(yàn)將對其藥效、藥理及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等內(nèi)容進(jìn)行完善，以期為開發(fā)該中藥凝膠制劑與進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。