許夢(mèng)榮，王川*，路鵬鵬，李慶智，梁濤，常卓琳，徐倉寶，張恩戶*（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西 咸陽 7046；.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所/陜西省缺血性心血管疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 700）

吸煙嚴(yán)重危害人類健康。吸煙不僅是當(dāng)今世界上最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，也是人類健康面臨的可預(yù)防的最嚴(yán)重危險(xiǎn)因素[1]。香煙燃燒時(shí)釋放出的物質(zhì)多達(dá)4000種，有害物質(zhì)主要有尼古丁、一氧化碳、氫氰酸、亞硝胺、內(nèi)毒素、苯并芘等[2-3]。香煙煙霧在肺部激活炎性細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)影響心血管功能；也可以激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，引起兒茶酚胺釋放增加，心率加快，動(dòng)脈痙攣，血壓升高；部分煙霧顆粒物也能直接穿過肺泡壁進(jìn)入肺循環(huán)系統(tǒng)，與心血管系統(tǒng)直接作用[4-6]。吸煙是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病、中風(fēng)等多種心血管疾病的重要危險(xiǎn)因子[7-8]，甚至能引起吸煙者的血管功能明顯紊亂[9]，據(jù)統(tǒng)計(jì)，冠心病和高血壓病患者中大約75%有吸煙史[10]。腎上腺素α1受體在心血管疾病中起重要作用，與心血管疾病中的血管收縮有關(guān)[11]。交感神經(jīng)興奮時(shí)釋放去甲腎上腺素，激動(dòng)腎上腺素α1受體，收縮血管。有研究表明，高血壓患者血管對(duì)腎上腺素α1受體激動(dòng)劑介導(dǎo)的收縮作用增強(qiáng)[12]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細(xì)胞應(yīng)激和損傷反應(yīng)的主要信號(hào)通路，介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖、分化、死亡等多種生理和病理過程[13]。ERK1/2-MAPK信號(hào)通路的激活與動(dòng)脈高反應(yīng)性密切相關(guān)[14]，研究表明吸煙損傷動(dòng)脈血管細(xì)胞，激活ERK1/2和NF-κB通路，使動(dòng)脈血管平滑肌內(nèi)皮素受體表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致動(dòng)脈血管平滑肌呈現(xiàn)高反應(yīng)性，ERK1/2信號(hào)通路也參與腎上腺素α1受體的調(diào)節(jié)作用，弱氧化型低密度脂蛋白激活 ERK1/2 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起TNF-α和 IL-1β水平增高，上調(diào)小鼠腸系膜動(dòng)脈腎上腺素α1受體，并且引起 腎上腺素α1受體介導(dǎo)血管收縮增強(qiáng)[15]。AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，AMPK的激活能夠調(diào)節(jié)能量代謝，具有心血管保護(hù)作用[16]。然而，香煙煙霧顆粒調(diào)節(jié)腎上腺素α1受體的作用機(jī)制還不十分清楚。研究香煙煙霧顆粒對(duì)腸系膜動(dòng)脈腎上腺素α1受體的作用，對(duì)闡明吸煙致病機(jī)制有重要意義，本研究擬從大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌收縮功能考察香煙煙霧顆粒誘導(dǎo)腎上腺素α1受體在動(dòng)脈高反應(yīng)性中的作用及其相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料

1.1 試藥

苯腎上腺素（PE）、乙酰膽堿（ACh）、二甲基亞砜（DMSO）、U0126、BAY 11-7082、AICAR、曲拉通X-100（Triton X-100）（Sigma公司）；腎上腺素α1受體抗體（Abcam）；β-actin、HRP Goat anti-Rabbi二抗（碧云天生物技術(shù)公司）。Na＋-PSS緩沖 液（mmol·L－1）：NaCl 119，NaHCO315，KCl 4.6，MgCl21.2，NaH2PO41.2，CaCl21.5和葡萄糖5.5（自制）；60 mmol·L－1K＋-PSS緩沖液為將Na＋-Krebs液中的NaCl換成相同摩爾濃度的KCl（自制）。DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone，Cat No：SH30022.01）。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，10～12周齡，體質(zhì)量（300±20）g [西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（陜）2015-003]。動(dòng)物飼養(yǎng)于西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院研究所動(dòng)物飼養(yǎng)室，室溫20～22℃，相對(duì)濕度（40±5）%，自由飲食飲水。

1.3 儀器

SZ51體視顯微鏡（日本奧林巴斯）；離體組織浴槽系統(tǒng)（丹麥DMT620）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）；肌張力描記記錄系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-RAD）。

2 方法

2.1 香煙煙霧顆粒二甲基亞砜溶解物（DSP）的制備

實(shí)驗(yàn)在負(fù)壓條件下進(jìn)行，將點(diǎn)燃的3支香煙（市售，尼古丁含量0.8 mg，焦油含量11 mg）通過負(fù)壓使煙霧經(jīng)過脫脂棉球，充分吸收煙霧后將脫脂棉球取出浸入1 mL DMSO中，使其充分溶解在DMSO中，過0.22 μm過濾器除菌，即得DSP[17]。

2.2 動(dòng)脈組織培養(yǎng)

雄性SD大鼠斷頸處死后，無菌條件下迅速分離出大鼠腸系膜，浸泡于過濾除菌并預(yù)冷的Na＋-PSS緩沖液中，顯微鏡下分離出腸系膜動(dòng)脈，0.1% Triton X-100血管內(nèi)灌注10 s，去除血管內(nèi)皮，剪成約1.5 mm的動(dòng)脈環(huán)，放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入1 mL 不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，通過不同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求在培養(yǎng)基中加入DSP或溶劑對(duì)照DMSO及相應(yīng)的信號(hào)通路阻斷劑（U0126、BAY 11-7082）或激活劑（AICAR）[16]。將培養(yǎng)板置于37℃含5% CO2氣體的培養(yǎng)箱內(nèi)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求培養(yǎng)不同的時(shí)間，每隔24 h更換一次培養(yǎng)基。

2.3 離體肌張力描記

將5 mL 的Na＋-PSS放入恒溫離體浴槽DMT內(nèi)，并將含95% O2和5% CO2的混合氣體不斷通入恒溫離體浴槽內(nèi)，用兩根呈L型的鋼針將動(dòng)脈環(huán)穿插連接起來，一根鋼針連接在張力傳感器上，另外一端則與微調(diào)裝置相連[17-19]。動(dòng)脈環(huán)每隔20 min施加0.5 mN的預(yù)張力，直至2 mN，血管環(huán)平衡40 min后，加入K＋-PSS緩沖液（60 mmol·L－1K＋），檢驗(yàn)動(dòng)脈環(huán)收縮活性，若血管環(huán)在兩次K＋-PSS液中的收縮幅度均大于 5 mN并且兩次收縮差異低于10%時(shí)，該血管環(huán)用于下一步實(shí)驗(yàn)，待第二次高濃度的K＋-PSS緩沖液引起的收縮穩(wěn)定后加入ACh，若ACh引起的舒張率＜10%，認(rèn)為動(dòng)脈內(nèi)皮已被去除[18-19]。采用濃度累加法加入PE（1×10－9～1×10－4mol·L－1），考察腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)。

2.4 Western blot

取培養(yǎng)24 h的血管，提取組織總蛋白，BCA法檢測(cè)樣品蛋白含量。蛋白經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的Tris-鹽緩沖液（TBST）室溫封閉1 h，加入一抗（腎上腺素α1受體、p-ERK、ERK抗體及內(nèi)參β-actin）4℃過夜，之后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，加入增加化學(xué)發(fā)光底物（ECL），使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)目標(biāo)帶的分子量和光密度值，分析相關(guān)蛋白表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。收縮性激動(dòng)劑在動(dòng)脈環(huán)上引起的收縮用60 mmol·L－1的K＋-PSS引起的收縮的百分?jǐn)?shù)表示。使用IBM SPSS Statistics 25.0軟件采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組數(shù)據(jù)間的比較[17]。

3 結(jié)果

3.1 DSP對(duì)腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

使用0.1、0.2和0.4 μL·mL－1DSP（1 mL培養(yǎng)基中加入0.1、0.2、0.4 μL的DSP，即得）與動(dòng)脈環(huán)共培養(yǎng)24 h，梯度累加法加入選擇性腎上腺素α1受體激動(dòng)劑PE，得累積濃度-反應(yīng)曲線見圖1。不同濃度的DSP均能誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)收縮，且收縮反應(yīng)呈濃度依賴性。與溶劑對(duì)照DMSO組相比，0.1 μL·mL－1DSP對(duì)去腎上腺素α1受體介導(dǎo)的氣管累積濃度-反應(yīng)曲線沒有明顯的影響，而DSP 0.2 μL·mL－1和DSP 0.4 μL·mL－1組腎上腺素α1受體介導(dǎo)的累積濃度-反應(yīng)曲線顯著左移（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot結(jié)果表明，DSP 0.2 μL·mL－1和DSP 0.4 μL·mL－1組均使腎上腺素α1受體的表達(dá)升高（P＜0.01）。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)DSP濃度選擇為DSP 0.2 μL·mL－1。

圖1 DSP對(duì)PE介導(dǎo)的累積濃度-反應(yīng)曲線的影響（A）及腎上腺素α1受體蛋白的表達(dá)（B）（±s，n＝6～8）Fig 1 Effect of DSP on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（A）and expression of α1-adrenoceptor protein（B）（±s，n＝6～8）

3.2 ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126對(duì)腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

為了考察ERK1/2信號(hào)通路是否參與了DSP引起的腸系膜動(dòng)脈收縮，在培養(yǎng)時(shí)加入特異性ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126（10 μmol·L－1）與0.2 μL·mL－1DSP共培養(yǎng)24 h。結(jié)果如圖2所示，與DSP組相比，ERK1/2信號(hào)通路抑制劑U0126可以顯著性抑制腎上腺素α1受體激動(dòng)劑PE誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)（P＜0.05，P＜0.01）。Western blot結(jié)果表明U0126可以降低腎上腺素α1受體的蛋白表達(dá)。DSP組p-ERK1/2蛋白的表達(dá)升高，表明DSP通過激活p-ERK1/2上調(diào)腎上腺素α1受體。DSP＋U0126組抑制了DSP誘導(dǎo)的腎上腺素α1受體上調(diào)。以上結(jié)果表明ERK1/2-MAPK信號(hào)通路可能參與了DSP上調(diào)腎上腺素α1受體引起的血管收縮。

圖2 ERK1/2抑制劑U0126對(duì)PE介導(dǎo)累積濃度-反應(yīng)曲線（A）的影響及腎上腺素α1受體蛋白的表達(dá)（B）（±s，n＝7～9）Fig 2 Effect of ERK1/2 inhibitor U0126 on cumulative concentrationreaction curve induced by PE（A）and expression of α1 adrenoceptor protein（B）（±s，n＝7～9）

3.3 NF-κB 通路抑制劑BAY 11-7082對(duì)腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

為了研究NF-κB是否和DSP誘導(dǎo)PE引起的收縮增強(qiáng)有關(guān)，加入0.2 μL·mL－1DSP和NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY 11-7082（10 μmol·L－1）與動(dòng)脈環(huán)共培養(yǎng)24 h。圖3結(jié)果顯示，與DSP組相比，NF-κB信號(hào)通路抑制劑BAY-117082不能消除DSP誘導(dǎo)PE增強(qiáng)血管收縮的作用。

圖3 NF-кB抑制劑BAY 11-7082對(duì)PE介導(dǎo)的累積濃度-反應(yīng)曲線的影響（±s，n＝9）Fig 3 Effect of NF-кB pathway inhibitor BAY 11-7082 on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（±s，n＝9）

3.4 AMPK信號(hào)通路激活劑AICAR對(duì)腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響

為了研究AMPK信號(hào)通路是否參與了DSP引起的腸系膜動(dòng)脈收縮，在培養(yǎng)時(shí)加入特異性AMPK信號(hào)通路激活劑AICAR（500 μmol·L－1）與0.2 μL·mL－1DSP共培養(yǎng)24 h。圖4結(jié)果表明，與DSP組相比，AICAR對(duì)DSP引起腎上腺素α1受體上調(diào)沒有明顯的影響，表明AMPK信號(hào)通路可能沒有參與DSP誘導(dǎo)腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)。

圖4 AMPK激活劑AICAR對(duì)PE介導(dǎo)累積濃度-反應(yīng)曲線的影響（±s，n＝8～10）Fig 4 Effect of AMPK pathway agonist AICAR on cumulative concentration-reaction curve induced by PE（±s，n＝8～10）

4 討論

吸煙與動(dòng)脈高反應(yīng)性密切相關(guān)，然而吸煙導(dǎo)致動(dòng)脈高反應(yīng)性的分子機(jī)制還不清楚。香煙煙霧不僅導(dǎo)致高血壓、冠心病、中風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化等一系列心血管疾病，還可引起血管的收縮及舒張功能失調(diào)造成相關(guān)的心血管疾病[14]。交感神經(jīng)興奮，末梢釋放腎上腺素，激動(dòng)血管平滑肌細(xì)胞膜上的腎上腺素受體，引起收縮血管，血管平滑肌的收縮功能是影響血管阻力的一個(gè)重要因素[20]。

本實(shí)驗(yàn)用離體器官培養(yǎng)技術(shù)，從大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌收縮功能研究DSP誘導(dǎo)腎上腺素α1受體在血管高反應(yīng)性中的變化及其相關(guān)信號(hào)通路。筆者發(fā)現(xiàn)DSP可引起大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌的腎上腺素α1受體介導(dǎo)的血管環(huán)收縮反應(yīng)增強(qiáng)，腎上腺素α1受體表達(dá)增加，且呈濃度依賴性，該現(xiàn)象可能與DSP誘導(dǎo)的腎上腺素α1受體上調(diào)有關(guān)。

U0126是ERK1/2通路特異性抑制劑，抑制MEK，阻斷MEK1/2激酶激活，抑制下游ERK1/2 激酶激活。DSP增強(qiáng)血管收縮的作用及上調(diào)腎上腺素α1受體的表達(dá)可以被ERK1/2抑制劑U0126抑制，表明DSP上調(diào)腎上腺素α1受體的作用可能與ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。

NF-κB是MAPK下游的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，BAY 11-7082是一種IκBα磷酸化和NF-κB抑制劑，選擇性且不可逆地抑制IκB-α磷酸化，并減少NF-κB和黏附分子的表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)BAY 11-7082不能消除DSP誘導(dǎo)PE增強(qiáng)血管收縮的作用，AMPK的激活具有保護(hù)心血管的作用，AICAR是AMPK的激活劑，能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為AMP類似物環(huán)腺苷-磷酸衍生物（ZMP），從而激活A(yù)MPK。本實(shí)驗(yàn)使用AICAR和DSP共培養(yǎng)，結(jié)果表明AICAR不能逆轉(zhuǎn)DSP引起的收縮，提示DSP上調(diào)腎上腺素α1受體引起的收縮增強(qiáng)可能與NF-κB和AMPK通路無關(guān)。

DSP可以誘導(dǎo)動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞腎上腺素α1受體上調(diào)，導(dǎo)致動(dòng)脈血管平滑肌對(duì)腎上腺素α1受體PE刺激呈高反應(yīng)性、動(dòng)脈血管收縮增強(qiáng)。ERK1/2信號(hào)通路將信息從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞內(nèi)，再轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)[21-23]。DSP激活ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可能激活其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制，合成新的腎上腺素α1受體，使動(dòng)脈血管平滑肌腎上腺素α1受體表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致動(dòng)脈血管平滑肌呈現(xiàn)高反應(yīng)性。因此，阻斷ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以抑制腎上腺素α1受體介導(dǎo)的收縮反應(yīng)，改善動(dòng)脈血管高敏感性和平滑肌高反應(yīng)性，達(dá)到治療血管痙攣性疾病的目的。

本課題通過研究DSP對(duì)腎上腺素α1受體介導(dǎo)的血管高反應(yīng)性的影響及機(jī)制，為血管高反應(yīng)性疾病提供新的治療靶點(diǎn)。本研究結(jié)果提示開發(fā)控制細(xì)胞內(nèi)ERK1/2信號(hào)通路的相關(guān)藥物是治療血管高反應(yīng)性疾病的新思路。