李永麗，王海美，波拉提·馬卡比力，田從魁，吳增寶*（1.中牟縣人民醫(yī)院藥學(xué)辦，鄭州451450；.湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；4.中央民族大學(xué)民族醫(yī)藥教育部重點實驗室，北京 100081）

西伯利亞白刺（Nitraria sibiricaPall.）是蒺藜科白刺屬植物，分布于蒙古、中亞、西伯利亞和中國；在中國主要分布于各沙漠地區(qū)[1]。與同屬唐古特白刺果實統(tǒng)稱白刺，在維藥和蒙藥中均有記載。其葉和果實均可入藥[2]。西伯利亞白刺為傳統(tǒng)的維藥，其葉可被用于治療高血壓、高血糖等癥[3]。但是對于其發(fā)揮活性的物質(zhì)基礎(chǔ)并不明確。本課題組前期在降血糖藥物篩選過程中，發(fā)現(xiàn)西伯利亞葉的總提取物具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，為進一步分離其活性成分并研究其降糖機制，對產(chǎn)于新疆沙灣縣郊區(qū)的西伯利亞白刺葉的化學(xué)成分進行了研究，從中分離得到10個化合物，并測定了其中單體化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 材料

ACQUITY QDa質(zhì)譜儀[美國Waters公司，電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）條件為正、負離子電離模式，掃描范圍m/z100～2000，質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過校正，毛細管電壓2 V]。采用ESI電噴霧離子源，離子源溫度200℃，錐孔氣為氮氣，碰撞氣為氦氣。錐孔電壓35～60 kV，碰撞電壓15～35 V）。1H-NMR和13C-NMR由Varian 600 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀測定（Varian公司），TMS為內(nèi)標；X-4型熔點測定儀（北京泰克儀器有限公司），柱色譜用硅膠（200～300目）和薄層色譜用硅膠G（青島海洋化工產(chǎn)品）。葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和ODS反相硅膠（Pharmacia公司）。半制備色譜儀（Waters 600型），色譜甲醇和乙腈（Fischer公司），水為Milli Q超純水，其他化學(xué)試劑均為分析純。Multiskan MK3 酶標儀（美國Thermo Electron公司）；LRH-150恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司），萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

西伯利亞白刺葉子采于新疆沙灣縣，經(jīng)湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院吳增寶副教授鑒定為西伯利亞白刺（Nitraria sibiricaPall.）的葉。標本存于湖北民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院標本室（編號：No.20130604-1）。

α-葡萄糖苷酶（批號：EC 232-604-7）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG，批號：EC 223-189-3）（Sigma公司），阿卡波糖（批號：100808-200501，中國食品藥品檢定研究院），各單體化合物均用DMSO溶解，用磷酸緩沖液配成不同濃度。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取分離

取干燥后西伯利亞白刺葉3.0 kg，粉碎成粗粉，95%乙醇回流提取3次，每次1 h，回收乙醇得到浸膏1500 g，取300 g浸膏用硅膠柱色譜分離，氯仿∶甲醇（100∶0～2∶1，V/V）梯度洗脫，得到Fr1～65。其中Fr6析出針羽狀結(jié)晶，經(jīng)95%乙醇重結(jié)晶后得到化合物1（160.0 mg），F(xiàn)r10～15合并，經(jīng)反相硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠色譜純化得到化合物3（20.2 mg）、化合物5（14.2 mg）和化合物6（18.1 mg），F(xiàn)r20～30合并經(jīng)反相硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠色譜半制備液相色譜，得到化合物2（14.6 mg）、化合物4（13.8 mg）、化合物7（23.3 mg）和化合物8（12.3 mg），F(xiàn)r.45～50合并，經(jīng)反相硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜純化后，再經(jīng)過Waters 600半制備純化，得到化合物9（17.1 mg）和化合物10（15.7 mg）。化合物1～10的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～10的結(jié)構(gòu)Fig 1 Sturctures of compound 1～10

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色針羽狀結(jié)晶。熔點134～138℃。與β-谷甾醇薄層對照，Rf值一致，故鑒定其為β-谷甾醇。

化合物2：白色粉末。UVλmax（MeOH）：309 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：6.28（1H，d，J＝16.8 Hz，H-8），6.80（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），7.42（1H，d，J＝16.8 Hz，H-7），7.48（2H，dd，J＝8.4 Hz，H-2，6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：125.6（C-1），129.8（C-2，6），115.7（C-3，5），159.6（C-4），142.8（C-7），114.6（C-8），168.9（C-9）。以上數(shù)據(jù)與文獻[4]報道的（E）-香豆酸一致，故鑒定其為（E）-香豆酸。

化合物3：黃色針羽狀結(jié)晶（甲醇）。熔點274～276℃。UVλmax（MeOH）：255 nm，367；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.56（1H，s，5-OH），10.81（1H，s，4'-OH），10.03（1H，s，7-OH），8.02（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），6.90（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.42（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.15（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：146.6（C-2），135.3（C-3），176.5（C-4），157.4（C-5），97.8（C-6），164.5（C-7），93.2（C-8），161.9（C-9），103.6（C-10），122.2（C-1'），129.9（C-2'，6'），115.2（C-3'，5'），160.8（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道的山柰素一致，故鑒定化合物3為山柰素。

化合物4：白色粉末。熔點：207～209℃。UVλmax（MeOH）：260 nm，293；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.46（2H，m，H-2，6），6.80（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），3.80（3H，s，3-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：121.1（C-1），113.9（C-2），147.5（C-3），150.7（C-4），112.8（C-5），123.2（C-6），167.0（COOH），55.5（3-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道的香草酸一致，故鑒定化合物4為香草酸。

化合物5：淡黃色粉末（甲醇），熔點：259～263℃。UVλmax（MeOH）：267，330 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.98（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），7.02（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.71（1H，s，H-3），6.30（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.05（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），3.83（3H，s，4'-OCH3），13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：162.2（C-2），103.5（C-3），180.5（C-4），161.5（C-5），100.2（C-6），169.5（C-7），94.5（C-8），157.5（C-9），101.5（C-10），121.5（C-1'），128.6（C-2'，6'），114.9（C-3'，5'），162.5（C-4'），55.8（4'-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道的5，7，3'，4'-四羥基黃酮醇一致，即金合歡素（acacetin），故鑒定化合物5為金合歡素。

化合物6：黃綠色粉末，熔點：312～315℃。UVλmax（MeOH）：256，374 nm；1H-NMR（600 MHz，acetone-d6）δ：12.33（1H，s，5-OH），9.90（1H，s，OH），8.54（1H，s，OH），8.31（1H，s，OH），8.01（1H，s，OH），7.88（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2'），7.75（1H，dd，J＝8.4，2.4 Hz，H-6'），7.04（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5'），6.58（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.24（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道的5，7，3'，4'-四羥基黃酮醇一致，即槲皮素（quercetin），故鑒定化合物6為槲皮素。

化合物7：淡黃色粉末（甲醇），熔點：345～347℃。UVλmax（MeOH）：264，336 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：7.90（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），7.00（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.77（1H，s，H-3），6.44（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.10（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.2（C-2），103.2（C-3），181.9（C-4），161.9（C-5），99.2（C-6），164.5（C-7），94.7（C-8），157.7（C-9），104.5（C-10），121.8（C-1'），129.1（C-2'，6'），116.5（C-3'，5'），161.9（C-4'）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的5，7，4'-三羥基黃酮一致，即芹菜素（apigenin），故鑒定化合物7為芹菜素。

化合物8：無色針晶（甲醇）。UVλmax（MeOH）：259，291 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.42（1H，s，COOH），9.39（1H，s，OH），9.25（1H，s，OH），7.30（1H，d，J＝1.2 Hz，H-2），7.26（1H，dd，J＝8.4，1.2 Hz，H-6），6.74（1H，d，J＝8.4 Hz，H-5），13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：121.9（C-1），116.7（C-2），144.5（C-3），150.3（C-4），115.5（C-5），121.8（C-6），167.9（C＝O）。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道的原兒茶酸（protocatechuic acid）一致，故鑒定化合物8為原兒茶酸。

化合物9：淡黃色粉末（甲醇），熔點：201～204℃。UVλmax（MeOH）：266，337 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.90（1H，s，5-OH），10.62（1H，s，4'-OH），7.96（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2'，6'），7.03（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3'，5'），6.74（1H，s，H-3），6.61（1H，d，J＝2.4 Hz，H-8），6.22（1H，d，J＝2.4 Hz，H-6），5.12（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），3.22～3.68（9H，m，H-2''-5''，6''a，2'''-5'''），3.90（1H，m，H-6''b），4.62（1H，br s，H-1'''），1.13（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6'''）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：164.5（C-2），103.3（C-3），182.9（C-4），161.7（C-5），99.4（C-6），162.5（C-7），94.6（C-8），157.5（C-9），104.8（C-10），120.8（C-1'），128.1（C-2'，6'），116.2（C-3'，5'），161.2（C-4'），98.9（C-1''），73.1（C-2''），76.2（C-3''），69.4（C-4''），75.6（C-5''），66.2（C-6''），100.8（C-1'''），70.1（C-2'''），70.5（C-3'''），72.2（C-4'''），68.2（C-5'''），17.5（C-6'''）。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道的5，7，4'-三羥基黃酮一致，即芹菜素-7-O-蕓香糖苷，故鑒定化合物9為芹菜素-7-O-蕓香糖苷。

化合物10：淡黃色粉末（甲醇），熔點：223～226℃。UVλmax（MeOH）：266，348 nm；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：12.97（1H，s，5-OH），7.99（2H，d，J＝9.0 Hz，H-2'，6'），6.93（2H，d，J＝9.0 Hz，H-3'，5'），6.47（1H，d，J＝1.8 Hz，H-8），6.20（1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），5.30（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），3.11～3.72（10H，m，H-2''-6''，2'''-5'''），4.42（1H，br s，H-1'''），1.10（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6'''）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ：156.6（C-2），133.7（C-3），178.1（C-4），161.2（C-5），99.0（C-6），163.4（C-7），94.1（C-8），156.9（C-9），104.0（C-10），120.8（C-1'），130.1（C-2'，6'），115.4（C-3'，5'），160.3（C-4'），101.2（C-1''），74.4（C-2''），76.5（C-3''），69.6（C-4''），75.8（C-5''），66.4（C-6''），100.9（C-1'''），70.3（C-2'''），70.6（C-3'''），72.0（C-4'''），68.0（C-5'''），17.4（C-6'''）。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的山柰素-3-O-蕓香糖苷一致，故鑒定化合物10為山柰素-3-O-蕓香糖苷。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

以p-NPG為底物，阿卡波糖為陽性對照，共設(shè)5個組，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別為A.空白組（緩沖液＋酶液＋底物）；B.空白對照組（緩沖液＋底物）；C.樣品測定組（樣品＋酶液＋底物）；D.樣品對照組（樣品＋緩沖液）；E.陽性對照組（阿卡波糖＋酶液＋底物）。每孔加入120 μL樣品或阿卡波糖的緩沖溶液（加少量DMSO助溶）和20 μLα-葡萄糖苷酶的緩沖溶液（空白組和對照組只加緩沖溶液），溫育15 min；每孔加入20 μL 5 mmol·L－1的p-NPG的緩沖溶液，溫育15 min，加入20 μL Na2CO3終止溶液，酶標儀于405 nm下測定OD值。抑制率（%）＝[1－（ODC－ODD）/（ODA－ODB）]×100%。在初篩有活性基礎(chǔ)上，再設(shè)計7～8個濃度，以濃度的對數(shù)-抑制率用Oringin軟件作圖，計算IC50值。結(jié)果β-谷甾醇（1）、（E）-香豆酸（2）、香草酸（4）、原兒茶酸（8）在1000 μg·mL－1對α-葡萄糖苷酶的抑制率低于50%，活性很弱；山柰素（3）、金合歡素（5）、槲皮素（6）、芹菜素（7）、芹菜素-7-O-蕓香糖苷（9）、山柰素-3-O-蕓香糖苷（10）均有較好活性，IC50分別為30.4、53.0、15.2、45.9、248.4、176.4 μmol·L－1。阿卡波糖的IC50為217.0 μmol·L－1。

3 討論

本研究首次對西伯利亞白刺葉進行了化學(xué)成分的分離，得到10個單體化合物，其中6個黃酮類、3個酚酸類和1個甾醇類成分。除β-谷甾醇外都為黃酮類或酚酸類成分，這與白刺屬植物所含的次生代謝產(chǎn)物相符，也與該屬植物所含黃酮類型相同（主要為黃酮醇類）。提示以黃酮類成分作為該屬特征成分并作為化學(xué)分類學(xué)是有一定的科學(xué)依據(jù)的。經(jīng)查閱文獻，從西伯利亞葉中分離所得到的槲皮素具有抗炎抗氧化和心血管保護、降血糖等多種活性[13]，山柰素具有抗炎抗氧化和降血糖等多種活性[14]、金合歡素具有抗炎抗氧化和心臟保護等多種藥理作用[15]、芹菜素具有抗炎抗氧化和心血管保護等活性[16]，α-葡萄糖苷酶的抑制活性測試結(jié)果表明，分離得到的幾種黃酮類成分均具有較好的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，且苷元的活性普遍強于苷的活性，提示白刺提取物的黃酮類成分可能是其降血糖作用的主要活性成分，可以作為降血糖的藥物進一步開發(fā)，但是除α-葡萄糖苷酶的抑制活性以外是否還有別的降糖機制，需要進一步研究闡明。