張尚霞,王宇紅*,龍紅萍,劉檢,趙洪慶,凌佳,牟晴蕊(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué),長沙410208;2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心,長沙 410208;.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長沙 410007)
郁金(Curcumae Radix)是姜科植物中廣西莪術(shù)、蓬莪術(shù)、溫郁金、姜黃的干燥塊根,郁金性苦寒,是活血化瘀的藥物,主要作用為理氣解郁、保肝利膽、祛瘀止血等,用于治療胸痹心痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、胸脅刺痛等臨床癥狀[1]?,F(xiàn)代藥理研究表明郁金具有抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化、抗血栓等作用[2-3],因此有必要對其化學(xué)成分進(jìn)行全面研究。目前對郁金化學(xué)成分的研究多采用傳統(tǒng)的提取分離鑒定,存在周期長、效率低的問題,亟需建立一個多成分快速分析、能提供盡可能豐富可靠數(shù)據(jù)的方法。
液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)擁有色譜的高分離性能和質(zhì)譜高靈敏度的特點(diǎn)[4-5],為中藥的質(zhì)量控制和資源合理利用奠定了基礎(chǔ),已被廣泛用于天然藥物的分析,極大地推動了中藥研究的發(fā)展。本文使用UPLC-Q-TOF-MS法,并結(jié)合中藥成分信息數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)[6-7],探討郁金的化學(xué)成分,為郁金的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。
MassHunter質(zhì)譜工作站、Agilent 1290UPLC-6540 accurate mass Q-TOF超高效液相-四級桿-飛行時間質(zhì)譜、Qualitative Analysis B.08.00數(shù)據(jù)處理軟件(美國Agilent公司);Metler Toledo PL402-L電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團(tuán));SK-7200HP超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司);Eppendorf Centrifuge5424 R離心機(jī)(德國艾本德公司)。
質(zhì)譜級甲酸、質(zhì)譜級乙腈、色譜級甲醇(Merck公司);蒸餾水(深圳屈臣氏蒸餾水有限公司)。溫郁金(湖南衡岳中藥飲片有限公司,產(chǎn)地:廣東,批號:190301,經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部張志國教授鑒定為姜科植物溫郁金的干燥塊莖)。莪術(shù)醇對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:100185-201908,純度:99.1%)。
稱取郁金藥材50 g,加入1000 mL圓底燒瓶中,并加入10倍量超純水后,加熱煮沸,冷凝管回流煮沸1.5 h,冷卻,三層紗布過濾,繼續(xù)加8倍量超純水,加熱煮沸,冷凝回流煮沸1 h,冷卻,三層紗布過濾,合并兩次水提藥液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后真空干燥箱干燥。精密稱取干燥后的浸膏0.2000 g,加入甲醇5 mL,超聲30 min充分溶解,3000 r·min-1離心5 min,取上清液置于1.5 mL離心管中,12 000 r·min-1離心5 min,取上清液混勻后微孔濾膜過濾,即得供試品溶液。
精密稱取對照品2.0 mg,置于10 mL量瓶,加70%的甲醇超聲溶解,定容成200 μg·mL-1的工作液母液,質(zhì)譜檢測時70%甲醇稀釋10倍,微孔濾膜過濾,即得對照品溶液。
色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);正離子模式時,流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水(B),負(fù)離子模式時,流動相為乙腈(A)-5 mmol·L-1乙酸銨水(B),梯度洗脫(0~10 min,5%~15%A;10~20 min,15%~30%A;20~30 min,30%~70%A;30~40 min,70%~95%A),流速為0.4 mL·min-1,進(jìn)樣量為2 μL。
應(yīng)用電噴霧正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測,掃描方式為MRE掃描,使用ESI-L Low Concentration Tuning Mix(G1969-8500)對準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行矯正。一級全掃質(zhì)量掃描范圍為m/z100~1500,分辨率為30 000,除溶劑氣體為氮?dú)?;干燥氣流速?.8 L·min-1;干燥氣溫度為325℃;毛細(xì)管電壓為4.0 kV;Fragment電壓為110 V;鞘氣溫度為350℃;二級質(zhì)譜使用依賴性掃描,在一級掃描基礎(chǔ)之上選擇前三強(qiáng)進(jìn)行誘導(dǎo)碰撞解離(CID)獲取其二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
根據(jù)Agilent Masshunter Qualitative Analysis工作站的特點(diǎn),設(shè)置有效的閾值參數(shù),對郁金水提物正負(fù)離子模式下采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,檢索化學(xué)成分的準(zhǔn)離子分子峰的信息,依據(jù)供試品質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰、碎片離子、色譜保留時間,結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[6]和中藥綜合數(shù)據(jù)庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)[7],參照化合物的對照品圖譜及電子期刊數(shù)據(jù)庫PubMed、CNKI,對郁金的化學(xué)成分的名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量等信息進(jìn)行分析。
郁金水提物正、負(fù)離子流圖如圖1所示。對郁金水提物正、負(fù)離子流圖進(jìn)行分析,結(jié)果共從郁金水提物中鑒定出52種已知化學(xué)成分,1種成分未知,化學(xué)成分的質(zhì)譜色譜信息如表1所示。
圖1 郁金水提物UPLC-Q-TOF-MS總離子流色譜圖Fig 1 TIC of water extract of Curcumae Radix by UPLC-Q-TOF-MS
表1 郁金水提物化學(xué)成分質(zhì)譜信息Tab 1 Chemical constituents in water extract of Curcumae Radix by UPLC-Q-TOF-MS
續(xù)表1
采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析郁金二級質(zhì)譜,以化學(xué)成分4、11、27、39、51為例,分析郁金化學(xué)成分裂解規(guī)律,結(jié)果如下:
化學(xué)成分4(tR=3.226 min)在正離子模式下m/z149.0591 [M+H]+,二級質(zhì)譜中碎片離子峰m/z103,與化學(xué)成分總離子峰相差46,推測可能是化學(xué)成分失去了1個CO2分子后的離子碎片,分析該化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解過程與其他文獻(xiàn)相一致[15],并參考該化學(xué)成分的色譜保留時間、質(zhì)譜總離子峰、裂解碎片等信息,因此,該化學(xué)成分被鑒定為肉桂酸,其裂解過程如圖2A。
化學(xué)成分11(tR=14.51 min)在正離子模式下m/z253.1805 [M+H]+,二級質(zhì)譜中主要碎片離子峰m/z235,與化學(xué)成分總離子峰相差18,推測可能是化學(xué)成分失去了1個H2O分子后的離子碎片,并參考該化學(xué)成分的色譜保留時間、總離子峰、裂解碎片等信息,鑒定其為郁金二醇。
化學(xué)成分27(tR=23.518 min)在正離子模式下m/z265.1457 [M+H]+,二級質(zhì)譜中主要碎片離子峰m/z247,與化學(xué)成分總離子峰相差18,推測可能是化學(xué)成分失去了1個H2O分子后的離子碎片,在負(fù)離子模式下m/z263.1274 [M-H]-,二級質(zhì)譜中主要碎片離子峰m/z245,與化學(xué)成分總離子峰相差18,推測可能是化學(xué)成分失去了1個H2O分子后的離子碎片,并參考該化學(xué)成分的色譜保留時間、總離子峰、裂解碎片等信息,該化學(xué)成分鑒定為反,反-1,7-二苯基-1,3-庚二烯-3-酮。
化學(xué)成分39(tR=27.266 min)在正離子模式下m/z237.1844 [M+H]+,二級質(zhì)譜中碎片離子峰m/z219,201,與文獻(xiàn)報道的莪術(shù)醇質(zhì)譜裂解過程相一致[16]。通過推測,碎片離子峰m/z219與化學(xué)成分總離子峰相差18,推斷可能是化學(xué)成分失去了1個H2O分子后的離子碎片,碎片離子峰m/z201與碎片離子峰m/z219相差18,推斷是碎片離子失去了1個H2O分子后的離子碎片,參考該化學(xué)成分的色譜保留時間、質(zhì)譜總離子峰、裂解碎片等信息,并與該化學(xué)成分的對照品相比較,該化學(xué)成分被鑒定為莪術(shù)醇,其裂解過程如圖2B。
圖2 郁金化學(xué)成分肉桂酸(A)、莪術(shù)醇(B)可能的裂解途徑Fig 2 Proposed fragmentation pathway of cinnamic acid(A),and curcumol(B)
化學(xué)成分51(tR=33.844 min)在正離子模式下m/z217.1587 [M+H]+,二級質(zhì)譜中碎片離子峰m/z201,與化學(xué)成分總離子峰相差15,推斷可能是化學(xué)成分失去了1個甲基化學(xué)基團(tuán)后的離子碎片,分析該化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解過程與其他文獻(xiàn)相一致[17],參考該化學(xué)成分的色譜保留時間、質(zhì)譜總離子峰、裂解碎片等信息,該化學(xué)成分被鑒定為芳姜黃酮。
將UPLC-Q-TOF-MS法分析獲得的52種郁金水提物化學(xué)成分進(jìn)行分類,可分為34種倍半萜類、4種二萜類、2種三萜類、4種姜黃素類、2種有機(jī)酸類和6種其他類化合物。
3.3.1 倍半萜類化合物 倍半萜類化合物是指分子中含15個碳原子并含有3個異戊二烯單元的天然萜類化合物,具有鏈狀、環(huán)狀等多種骨架結(jié)構(gòu)。本研究從郁金水提物中鑒定出34種倍半萜類化合物,分別為:zedoarolide B(5)、zedoalactone A(6)、zedoalactone B(8)、curcumenolactone C(9)、郁金二醇(11)、zedoalactone C(12)、異莪術(shù)烯醇(14)、歐亞活血丹內(nèi)酯(15)、異郁金二醇(16)、呋喃大牻牛兒酮(17)、香豆酚(18)、表莪術(shù)酮(19)、zedoarol(21)、aerugidiol(22)、polydactin B(24)、異原莪術(shù)烯醇(25)、郁金烯酮(28)、呋喃二烯(29)、莪術(shù)烯(31)、(1S,4S,5S,10R)-zedoarondiol(32)、二氫莪術(shù)二酮(33)、呋喃二烯酮(34)、石竹烯氧化物(35)、curdionolide B(37)、gajutsulactone A(38)、莪術(shù)醇(39)、4-epi-curcumenol(40)、costunolide(41)、zederone(42)、curcumenol(43)、codonolactone(44)、β-cuparenone(45)、8-hydroxycadalene(48)和桂莪術(shù)內(nèi)酯(50)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示。
圖3 郁金水提物的倍半萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 3 Chemical structure of sesquiterpenoids in water extract of Curcumae Radix
3.3.2 二萜類化合物 二萜類化合物是由4個異戊二烯單位構(gòu)成,含20個碳原子的化合物類群,結(jié)構(gòu)顯示多樣性。本研究從郁金水提物中鑒定出4種二萜類化合物,分別為:curcuminol C(7)、curcuminol D(46)、curcuminol A(49)和curcuminol B(52)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖4所示。
圖4 郁金水提物的二萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 4 Chemical structure of diterpenoids in water extract of Curcumae Radix
3.3.3 三萜類化合物 三萜類化合物是由數(shù)個異戊二烯去掉羥基后首尾相連構(gòu)成的物質(zhì),大部分含30個碳原子,少部分含27個碳原子的萜類化合物,在自然界分布廣泛。本研究從郁金水提物中鑒定出2種三萜類化合物,分別為促黃素Ⅱ(26)和二呋喃莪術(shù)烯酮(47)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5所示。
圖5 郁金水提物的三萜類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 5 Chemical structure of triterpenoids in water extract of Curcumae Radix
3.3.4 姜黃素類化合物 姜黃素類化合物按化學(xué)結(jié)構(gòu)特征分為單氧代型、雙氧代型、三氧代型、吡喃取代型、呋喃取代型、大環(huán)醚型、二聚體型等7個類型,對人體無毒,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。本研究從郁金水提物中鑒定出4種姜黃素類化合物,分別為二氫姜黃素(23)、姜黃醇酮(30)、甜沒藥姜黃醇(36)和芳姜黃酮(51)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖6所示。
圖6 郁金水提物的姜黃素類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 6 Chemical structure of curcumin in water extract of Curcumae Radix
3.3.5 有機(jī)酸類化合物 有機(jī)酸類化合物是指一些具有酸性的有機(jī)化合物,最常見的有機(jī)酸是羧酸,這些化合物中的一部分能夠參與動植物代謝進(jìn)程。本研究從郁金水提物中共鑒定出2種有機(jī)酸類化合物,分別為焦谷氨酸(1)和肉桂酸(4)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖7所示。
圖7 郁金水提物的有機(jī)酸類化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig 7 Chemical structure of organic acids in water extract of Curcumae Radix
3.3.6 其他類化合物 本研究從郁金水提物中鑒定出6種其他類化合物,分別為heterodendrin(2)、酪胺(3)、(E)-1,7-diphenyl-3-hydroxy-1-hepten-5-one(10)、反-1,7-二苯基-1-庚烯-5-醇(13)、反,反-1,7-二苯基-1,3-庚二烯-3-酮(27)和枯茗醛(53)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖8所示。
目前,文獻(xiàn)報道對郁金成分的研究多采用醇提法[18],或采用超臨界流體萃取分離后,用氣相色譜-質(zhì)譜法分析[19],或采用固相微萃取后,經(jīng)過氣相色譜和質(zhì)譜進(jìn)行分析[20],或用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油后,用GC-MS分析[21],一般傾向于檢測揮發(fā)類成分,無法系統(tǒng)闡釋郁金的中等極性及大極性成分,缺乏對郁金成分的系統(tǒng)而全面的研究。本研究采用水提法提取郁金中的化學(xué)成分,可以進(jìn)一步探討郁金的中等極性及大極性成分,同時研究表明郁金水提物的化學(xué)成分可能具有抗抑郁、抗血栓、改善學(xué)習(xí)記憶能力等作用[22-24]。錢海兵等[22]研究表明郁金水提物對抑郁癥大鼠的獎賞行為、自發(fā)性探索行為均有一定的療效,且對抑郁癥大鼠海馬區(qū)的血管新生有一定的作用;宿玉等[23]研究表明桂郁金水提物可以調(diào)節(jié)前列環(huán)素(PGI2)和血栓素A2(TXA2)之間的相對穩(wěn)定,主要通過增加內(nèi)皮細(xì)胞中PGI2的分泌,降低TXA2的合成,抑制血小板聚集并起到抗血栓的作用;李紀(jì)彤等[24]研究表明溫郁金水提物可以改善Aβ25-35引起的小鼠阿爾茨海默病的學(xué)習(xí)記憶能力。因此,本文對郁金水提物的成分進(jìn)行分析,旨在全面系統(tǒng)地分析郁金的有效物質(zhì)基礎(chǔ)。
本研究選擇UPLC-Q-TOF-MS法探討郁金水提物中的化學(xué)成分,從郁金水提物中鑒定出52種化學(xué)成分,包括34種倍半萜類、4種二萜類、2種三萜類、4種姜黃素類、2種有機(jī)酸類和6種其他類化合物,為郁金臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。