呂彩霞 苑曉燁 邵偉華 林華 王素星 趙景茹 張明明

胃癌是老年人群中最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，因老年人常合并多系統(tǒng)疾病，往往不能耐受手術(shù)及放化療治療，特別是晚期胃癌，即使行胃癌擴大根治術(shù)，5年生存率仍較低[1]，因此加強胃癌發(fā)病機制的研究意義重大。胃癌的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，其中機體免疫狀況與胃癌的進展密不可分。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Tregs)作為一類特殊的T淋巴細胞亞群，在免疫抑制方面發(fā)揮作用，特別是在胃癌病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Tregs增高與機體免疫功能低下正相關(guān)[2]，因此抑制胃癌病人的Tregs水平可能對控制胃癌進展有效。近來研究證實，黃芪可提高機體免疫功能狀態(tài)[3]。然而關(guān)于黃芪是否影響胃癌病人體內(nèi)Tregs的表達及功能尚不明確，因此本研究以老年晚期胃癌病人為研究對象，予以黃芪多糖治療，檢測治療前后病人Tregs的表達及免疫抑制功能，探討黃芪多糖在胃癌治療中的臨床意義及價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年6月至2019年12月我院收治的晚期胃癌病人60例，年齡60～75歲，隨機分為對照組、低劑量組及高劑量組，每組20例。對照組男12例，女8例，年齡(68.0±7.3)歲；低劑量組男11例，女9例，年齡(69.0±7.2)歲；高劑量組男13例，女7例，年齡(67.0±6.8)歲，3組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。高劑量組給予 250 mg 黃芪多糖靜脈滴注，1 次/d，共7 d；低劑量組給予125 mg 黃芪多糖靜脈滴注，1次/d，共7 d；對照組給予5%葡萄糖注射液。以上病人均簽署知情同意書，且通過河北省人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：所有病人均經(jīng)病理活檢證實為胃癌；TNM分期為Ⅳ期；在入組前均未接受放化療、免疫治療及激素治療等。排除標準：感染性疾病、肝腎疾病、甲狀腺功能異常及自身免疫系統(tǒng)疾病等，或者正在服用抗炎藥物。

1.2 主要儀器及試劑 注射用黃芪多糖(250 mg/支，批準文號220040086，天津賽諾制藥公司產(chǎn)品)，流式 細 胞 儀 FACS-CALIBUR (BD公司)；抗 人FITC-CD4、 PE-CD25與PE-cy5 FoxP3單克隆抗體(均為eBioscience產(chǎn)品)，IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)ELISA試劑盒(中國欣博盛生物有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標本收集：所有受試者于用藥前及用藥結(jié)束后3 d，清晨空腹經(jīng)肘靜脈抽取外周血5 mL，離心機2500 r/min離心10 min，上層血清-80 ℃冰凍保存用于細胞因子檢測，下層血細胞用于流式細胞術(shù)檢測。

1.3.2 外周血中CD4+CD25+Tregs 及CD4+CD25+FoxP3+Tregs的測定：應(yīng)用淋巴細胞分離液梯度離心法分離外周單核細胞(PBMCs)，PBMCs用1640培養(yǎng)基孵育于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜以貼壁去除單核巨噬細胞。每孔2×106細胞數(shù)置于 24孔細胞培養(yǎng)板中，CD3和CD28刺激24 h，收集細胞洗滌后，進行流式免疫熒光抗體標記，首先用抗人CD4抗體與抗人CD25抗體于4 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌，根據(jù)試劑盒說明用固定破膜液處理后，加入抗人FoxP3抗體，避光于4 ℃ 孵育30 min后，PBS洗滌，流式細胞儀檢測CD4+CD25+Tregs 及CD4+CD25+FoxP3+Tregs各亞群的表達比例。

1.3.3 血清中Tregs相關(guān)細胞因子的測定：應(yīng)用ELISA法檢測細胞因子IL-10、TGF-β1含量。

2 結(jié)果

2.1 3組外周血CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25+FoxP3+Tregs水平比較 對照組及低劑量組用藥前后CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25+FoxP3+Tregs的表達均未見明顯差異；高劑量組無論CD4+CD25+Tregs還是CD4+CD25+FoxP3+Tregs表達均較用藥前明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 3組外周血中CD4+CD25+Tregs及CD4+CD25+FoxP3+Tregs水平比較(n=20)

2.2 3組Tregs相關(guān)免疫抑制因子水平比較 高劑量組的IL-10及TGF-β1水平較用藥前明顯減少(P<0.05)；而對照組的IL-10及TGF-β1水平較用藥前未見明顯減少，低劑量組TGF-β1水平較用藥前降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組外周血中IL-10及TGF-β1水平比較(n=20)

3 討論

胃癌發(fā)病機制復(fù)雜、病程長、預(yù)后差，嚴重威脅我國居民生命健康。盡管目前胃癌的臨床治療進展迅速，手術(shù)、放化療、生物靶向治療以及基因治療在一定程度上可延緩胃癌的進展，但是其病死率仍居高不下[4]，特別是晚期胃癌病人，因喪失最佳治療時機，往往治療效果及預(yù)后較差。因此針對選擇保守治療的老年晚期胃癌病人，在臨床中探尋一種更安全可靠的藥物治療意義重大。

黃芪是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中歷史悠久的臨床藥物之一，從其中可提取出一類天然物質(zhì)——黃芪多糖，其具有增強機體免疫功能、抗炎、抗病毒的特性[5]，在臨床中常作為免疫調(diào)節(jié)劑用于改善惡性腫瘤病人的免疫功能低下[6]。造成惡性腫瘤病人免疫功能低下的原因有很多，其中過度激活的Tregs介導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)參與了腫瘤病人體內(nèi)的免疫失衡。資料顯示，在多種腫瘤病人的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Tregs數(shù)量增多，并且其水平的高低與腫瘤的進展密切相關(guān)[7]。Tregs是一類具有免疫抑制作用的T淋巴細胞亞群，在正常人體外周血的CD4+T淋巴細胞中約占5%～10%。Tregs在炎癥性疾病、動脈粥樣硬化疾病及自身免疫性疾病中發(fā)揮正向作用，是一類具有免疫負性調(diào)節(jié)功能的T淋巴細胞[8]；然而在腫瘤的進展中，因其參與腫瘤的免疫逃逸及抑制機體免疫功能而發(fā)揮負向作用[7,9]。研究表明,黃芪多糖在免疫抑制模型及黑色素瘤模型中，可抑制Tregs的增高[10-11]；然而在胃癌中，黃芪多糖是否調(diào)控Tregs的表達，未見明確報道。

Tregs的特征性標志物是 CD4及CD25表面分子，以及細胞內(nèi)分子FoxP3。FoxP3是表達于細胞內(nèi)的叉頭狀分子，在調(diào)控Tregs的生長發(fā)育及發(fā)揮免疫抑制功能方面起重要作用，是目前檢測Tregs表達及功能的精準分子之一[12]。Tregs發(fā)揮免疫抑制作用，可通過細胞直接接觸抑制其他免疫細胞的活性及增殖，例如抑制效應(yīng)性T 細胞等對腫瘤的殺傷作用，是造成腫瘤免疫逃逸及腫瘤轉(zhuǎn)移的主要原因[13]。臨床試驗顯示,通過清除惡性腫瘤病人體內(nèi)的Tregs可抑制腫瘤的生長，甚至消除部分腫瘤[14-15]。研究表明，與正常人相比，胃癌病人的組織及外周血中可發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Tregs的表達升高，特別是在晚期胃癌病人中，CD4+CD25+Tregs的表達明顯升高，并且升高比例與胃癌病人的病死率正相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖在治療老年晚期胃癌病人后，CD4+CD25+Tregs的表達比例明顯減低，與前期研究相符；進一步檢測FoxP3的表達發(fā)現(xiàn)：FoxP3+/CD4+CD25+Tregs的表達比例在應(yīng)用黃芪多糖后明顯降低；應(yīng)用黃芪多糖降低老年晚期胃癌病人外周血中CD4+CD25+FoxP3+Tregs的表達比例，提示黃芪多糖可破壞Tregs誘導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境，改善胃癌病人低下的免疫功能狀態(tài)。

Treg發(fā)揮免疫抑制功能，除了通過細胞直接接觸外，還能夠分泌抑炎因子TGF-β1 及IL-10等間接發(fā)揮免疫抑制作用[17-18]。研究表明，腫瘤病人體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)TGF-β1水平增高，TGF-β1不僅能誘導(dǎo) Treg 的表達升高，還能夠抑制細胞毒性T淋巴細胞增殖活化，導(dǎo)致機體的腫瘤殺傷力降低。IL-10是一類具有明顯抗炎作用的細胞因子，通過減少抗原特異性 T 細胞的增殖活化，減少單核巨噬細胞分泌的炎性因子等發(fā)揮免疫抑制作用。有研究表明，黃芪多糖可降低腫瘤模型中TGF-β1 及IL-10的表達[19]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用高劑量黃芪多糖可明顯降低老年晚期胃癌病人外周血中TGF-β1 及IL-10的含量，提示黃芪多糖可能通過抑制TGF-β1 及IL-10的產(chǎn)生改善胃癌病人體內(nèi)的過度免疫抑制狀態(tài)。

綜上所述，黃芪多糖可能通過降低CD4+CD25+FoxP3+Tregs的表達及其抑制功能，提高胃癌病人的免疫功能，延緩胃癌的進展，本研究為黃芪多糖的抗腫瘤治療提供免疫學證據(jù)。