楊若琪, 趙貴萍, 李 泉*

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院, 山東 濟(jì)南 250355; 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 中醫(yī)科, 山東 濰坊 261000; 3. 云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院, 云南 昆明 650500)

齲齒是一種由口腔致病菌引起的局部感染性疾病[1].食物、宿主以及微生物都在齲齒的形成過程中起著重要的作用[2].在人類口腔環(huán)境的多種細(xì)菌中,變形鏈球菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸性以及形成生物被膜的能力,被認(rèn)為是主要致齲病原體[3].使用抗菌藥物(例如氟化物或洗必泰)是目前預(yù)防齲齒的主要策略之一[4].然而,當(dāng)抗菌藥物對(duì)病原菌起作用時(shí),益生菌在口腔中的生長也受到了影響,這可能會(huì)導(dǎo)致口腔菌群的失調(diào)以及牙漬和味覺改變等副作用的發(fā)生[5].在過去的幾年中,研究人員對(duì)來源于植物的天然化合物產(chǎn)生了極大的興趣,這些化學(xué)治療藥物的細(xì)胞毒性較低,并且具有潛在的抗齲活性[6].

作為應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)中藥,甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)具有止咳、抗炎和抗菌的功效,其藥理活性主要存在于以甘草素為代表的黃酮類化合物(flavonoids)和以甘草酸、甘草次酸為代表的三萜皂苷類化合物(triterpenoid saponins)中[7].研究顯示,甘草中的一些活性化合物對(duì)牙齒疾病已經(jīng)表現(xiàn)出了不同程度的治療作用[8].本文通過測(cè)定甘草提取物的不同餾分對(duì)變形鏈球菌浮游細(xì)胞代謝活性、生物被膜形成以及產(chǎn)酸性的影響,為抗齲藥物的研發(fā)提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 材料

甘草藥材(康美藥業(yè)股份有限公司)、變形鏈球菌UA159(山東中醫(yī)藥大學(xué)微生物教研室提供)、腦心浸液培養(yǎng)基(BHI,北京奧博星生物技術(shù)有限公司)、噻唑藍(lán)(MTT,5 mg·mL-1,江蘇凱基生物技術(shù)有限公司).

1.2 主要儀器設(shè)備

96孔板(南通海之星實(shí)驗(yàn)器材公司)、2.5 L厭氧產(chǎn)氣包(青島海博生物科技有限公司)、DNM-9602型酶標(biāo)儀(北京普朗公司)、PHS-3C型pH計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司).

1.3 方法

1.3.1 甘草粗提物的制備以及各餾分的萃取

甘草粗提物的制備根據(jù)蔡昀盈等[9]的方法并稍加修改.將甘草藥材干燥并用攪拌機(jī)壓成粉末,按照1∶8(g·mL-1)的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇作為提取劑,在80 ℃水浴回流提取2 h后,將提取物過濾并加入相同體積的提取劑重復(fù)上述過程1次.合并2次所得的濾液,經(jīng)旋蒸濃縮后,用無菌蒸餾水溶解獲得甘草粗提物,依次使用石油醚、乙酸乙酯和乙醇按照1∶3的體積比萃取3次,得到各有機(jī)層的餾分.

1.3.2 MTT試驗(yàn)

將變形鏈球菌UA159過夜培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期,用BHI培養(yǎng)基稀釋至菌落數(shù)為5×105CFU·mL-1.將甘草提取物的不同餾分在96孔板中通過倍比稀釋法配置成一系列所需質(zhì)量濃度,與細(xì)菌在2.5 L厭氧產(chǎn)氣包中共同孵育24 h.將10 μL的MTT加入到每個(gè)孔中,37 ℃避光反應(yīng)3 h后再向每個(gè)孔中加入二甲基亞砜溶液.使用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度,試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù).

1.3.3 生物被膜形成試驗(yàn)

過夜培養(yǎng)的變形鏈球菌UA159菌液用含有質(zhì)量濃度為0.25 g·mL-1的蔗糖BHI培養(yǎng)基稀釋至菌落數(shù)為1×107CFU·mL-1.將倍比稀釋的藥物與細(xì)菌在厭氧環(huán)境中共同孵育24 h,然后小心除去每個(gè)孔中的上清液,并用無菌磷酸緩沖鹽溶液洗滌形成的生物被膜.使用體積分?jǐn)?shù)為0.4%結(jié)晶紫溶液對(duì)生物被膜進(jìn)行染色,再次用無菌磷酸緩沖鹽溶液洗去多余的染料,最后加入體積分?jǐn)?shù)為33%乙酸溶液靜置15 min.使用酶標(biāo)儀測(cè)量590 nm處的吸光度,試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù).

1.3.4 糖酵解pH值下降試驗(yàn)

將菌落數(shù)為1×107CFU·mL-1的變形鏈球菌UA159與不同質(zhì)量濃度的藥物一起添加到96孔板中.在將初始pH值調(diào)節(jié)至7.1后,每隔2 h測(cè)量1次每個(gè)孔的pH值,試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù).

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件(IBM SPSS Statistics 25, USA)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA).結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示.當(dāng)P< 0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 甘草提取物的不同餾分對(duì)變形鏈球菌浮游細(xì)胞代謝活性的影響

用甘草提取物的不同餾分處理變形鏈球菌浮游細(xì)胞24 h后,結(jié)果如圖1所示.8 mg·mL-1的粗提物與對(duì)照組相比相對(duì)降低了變形鏈球菌浮游細(xì)胞約70%的代謝活性(P< 0.01),5 mg·mL-1的乙醇餾分則相對(duì)降低了約80%的代謝活性(P< 0.01).乙酸乙酯餾分的抑制效果最為明顯,質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1時(shí)能夠相對(duì)降低約75%的代謝活性(P< 0.01).

(a) 粗提物質(zhì)量濃度對(duì)浮游細(xì)胞代謝活性的影響(b) 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)浮游細(xì)胞代謝活性的影響(c) 乙酸乙酯質(zhì)量濃度對(duì)浮游細(xì)胞代謝活性的影響

2.2 甘草提取物的不同餾分對(duì)變形鏈球菌生物被膜形成的影響

通過在培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度為0.25 g·mL-1的蔗糖使變形鏈球菌形成生物被膜,藥物處理24 h后結(jié)果如圖2所示.與對(duì)照組相比,5 mg·mL-1的乙醇餾分以及3 mg·mL-1的乙酸乙酯餾分對(duì)變形鏈球菌生物被膜的形成表現(xiàn)出了顯著的抑制活性,大約減少了相對(duì)85%的生物被膜形成(P<0.01).粗提物的抑制作用稍弱,8 mg·mL-1時(shí)生物被膜的形成相對(duì)減少了約70%(P<0.01).

(a) 粗提物質(zhì)量濃度對(duì)生物被膜形成的影響(b) 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)生物被膜形成的影響(c) 乙酸乙酯質(zhì)量濃度對(duì)生物被膜形成的影響

2.3 甘草提取物的不同餾分對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸性的影響

甘草提取物的不同餾分對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸性的影響如圖3所示. 對(duì)照組的pH值從開始的7.1下降至最終的4.1, 而藥物處理組的pH值變化明顯減弱,4.00 mg·mL-1的粗提物、2.50 mg·mL-1的乙醇餾分以及1.50 mg·mL-1的乙酸乙酯餾分在處理12 h后的最終pH值仍然在6.0左右. 同時(shí)2.00 mg·mL-1的粗提物、1.25 mg·mL-1的乙醇餾分以及0.75 mg·mL-1的乙酸乙酯餾分在處理4 h后也保持著6.0左右的pH值, 盡管在處理12 h后, 它們的最終pH值與對(duì)照組相比幾乎沒有差別.

(a) 粗提物質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酸性的影響(b) 乙醇質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酸性的影響(c) 乙酸乙酯質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酸性的影響

3 討 論

盡管人們對(duì)口腔健康越來越重視,但齲齒的患病率仍然以驚人的速度上升[10].變形鏈球菌在齲齒發(fā)病機(jī)理中的作用已有充分文獻(xiàn)記載.變形鏈球菌的主要致齲特性是其能形成生物被膜以及通過糖酵解途徑產(chǎn)生有機(jī)酸[11].因此,能夠有效地控制變形鏈球菌生物被膜的形成以及有機(jī)酸產(chǎn)生的新型抗齲藥物是研究人員關(guān)注的重點(diǎn).

牙菌斑生物被膜是一種能夠黏附在有機(jī)或無機(jī)材料表面的致齲性微生物群落[12].生物被膜中的細(xì)菌通常被包裹在胞外聚合物基質(zhì)中(由多糖、蛋白質(zhì)以及胞外DNA組成),與浮游細(xì)菌相比,生物被膜對(duì)抗菌藥物,宿主免疫防御機(jī)制和惡劣的外部環(huán)境都具有很強(qiáng)的抵抗力,這也使得齲病的預(yù)防和治療變得更加困難[4].在本研究中,甘草提取物的不同餾分都對(duì)變形鏈球菌生物被膜的形成表現(xiàn)出了不同程度的抑制作用.綜合來看,乙酸乙酯餾分所需的質(zhì)量濃度最低,抑制效果略強(qiáng)于乙醇餾分,而粗提物的抑制活性相較于二者則明顯下降.大量研究表明,許多黃酮類化合物對(duì)口腔細(xì)菌,特別是變形鏈球菌表現(xiàn)出了良好的抗菌活性,例如Liu等[13]發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過增加細(xì)菌的表面疏水性從而抑制生物被膜的形成.甘草中也含有大量的黃酮類化合物,推測(cè)乙酸乙酯餾分中某些極性偏小的黃酮苷元可能是其抑制作用較強(qiáng)的主要原因.對(duì)甘草提取物各級(jí)餾分中所含主要活性成分的分離和鑒定是未來研究的主要方向之一.

致齲細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)酸也是導(dǎo)致齲齒形成的主要原因之一[14].變形鏈球菌能夠黏附在牙齒的硬組織上,通過分解食物中的碳水化合物產(chǎn)生有機(jī)酸,從而使牙釉質(zhì)脫礦并形成齲齒[15].在本研究中,甘草提取物的不同餾分處理后,pH值的變化與對(duì)照組相比都有所減小,粗提物、乙醇餾分以及乙酸乙酯餾分對(duì)變形鏈球菌產(chǎn)酸性的抑制作用效果相當(dāng).

目前天然產(chǎn)物在齲病防治方面仍面臨著許多不可忽視的挑戰(zhàn).盡管目前的提取分離技術(shù)已經(jīng)比較成熟,但是從復(fù)雜天然產(chǎn)物中提純各種有效成分依舊非常困難.甘草提取物中單個(gè)分子對(duì)變形鏈球菌生物被膜形成的影響及其相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步研究.此外,口腔中沒有特異的致齲菌,用一種特殊細(xì)菌來解釋齲病的發(fā)生是不可能的.未來我們將使用多菌株生物被膜模型來盡可能地模擬真實(shí)口腔內(nèi)各種細(xì)菌間的生態(tài)關(guān)系.