邵憶閔,吳 湧

邵憶閔,桐廬縣中醫(yī)院藥劑科 浙江省杭州市 311500

吳湧,浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部 浙江省杭州市 310006

0 引言

結(jié)直腸癌是一種常見的腸道惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢,且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢[1].我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率已躍居所有惡性腫瘤前5位[2].腫瘤切除術(shù)后輔以化療仍然是治療結(jié)直腸癌的主要手段,但由于臨床常用的化療藥物常具有較高的毒副作用,從而嚴重影響患者的生存質(zhì)量[3,4].因此,迫切需要尋找新型高效低毒的藥物來替代常用的化療藥物.天然生藥提取物因具有豐富的藥理活性以及毒性小的特點,其在腫瘤治療方面可能具有良好的應(yīng)用前景[5].胡椒堿(piperine,PIP)是一種從黑胡椒中提取的生物堿類活性化合物,其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和促進藥物代謝等多種藥理活性[6-8].雖然,目前關(guān)于PIP的抗腫瘤效應(yīng)已經(jīng)進行了一些相關(guān)的基礎(chǔ)研究[6,7],但其對結(jié)直腸癌細胞的具體生物學(xué)功能及機制的研究并不完善.因此,本研究選用結(jié)腸癌SW480細胞作為研究對象,旨在探究PIP對SW480細胞細胞遷移和侵襲能力的影響以及潛在的生物學(xué)機制,以評估其作為潛在的抗結(jié)腸癌候選藥物的可能性.

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌SW480和HT-29細胞株購于中科院上海細胞庫,人正常結(jié)腸粘膜上皮細胞系FHC購于美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC) 細胞庫,人正常結(jié)腸粘膜上皮細胞系NCM460購于通派(上海)生物科技有限公司.改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco,DMEM)、L-15培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Gibco公司;PIP(純度＞98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)試劑購自Sigma公司;細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒、5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)試劑盒、β-肌動蛋白(beta-Actin,β-Actin)抗體以及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的二抗購自上海碧云天生物科技有限公司;Ⅱ型微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)抗體購自Abcam公司;LC3、p53、B細胞淋巴瘤/白血病-2 (B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白 (Bcl-2 associated X protein,Bax)、劈裂的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine aspartate proteinase-3,Cleaved caspase 3)抗體購自Cell Signaling Technology公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與溶液制備:將SW480和HT-29細胞培養(yǎng)于含有10%FBS,100 μU/mL青霉素-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基中,FHC和NCM460細胞培養(yǎng)于含有10%FBS,100 μU/mL青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,上述細胞均置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 C C K-8法檢測細胞活性:取對數(shù)生長期的SW480、HT-29、FHC和NCM460細胞用胰蛋白酶消化后將其接種在96孔板中(5×103細胞/孔)每孔做3個復(fù)孔,待細胞貼壁后,分別用不同濃度的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理細胞24 h,用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,并在37 ℃孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測吸光度值A(chǔ).細胞活性=(A實驗組-A對照組)/A對照組×100%.

1.2.3 EdU染色檢測細胞增殖:取對數(shù)生長期的SW480細胞用胰蛋白酶消化后將其接種在96孔板中(5.0×103細胞/孔)每孔做3個復(fù)孔,待細胞貼壁后,分別用不同濃度的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理細胞24 h.每孔加入50 μM EdU試劑,并在37 ℃孵育2 h,按照試劑盒說明書步驟,對細胞固定和透化后,每孔加入100 μL Appollo?567染色反應(yīng)液避光孵育30 min,然后用DAPI染核.在熒光顯微鏡下觀察,隨機視野拍照并對EdU陽性細胞計數(shù).

1.2.4 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲:用24孔Transwell小室(聚碳酸酯膜,8 μm孔徑)檢測細胞的遷移以及侵襲.收集已被0、5、10、20 μg/mL PIP處理24 h的SW480細胞,并將其用無血清培養(yǎng)基制成2.0×105個/mL的單細胞懸液.進行侵襲實驗時,Transwell板上室內(nèi)膜表面鋪有Matrigel基質(zhì)膠,并取100 μL細胞懸液加入上室,在下室中加入700 μL含10%FBS的培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)24 h.

遷移實驗除了不進行鋪Matrigel基質(zhì)膠外,其他步驟同細胞侵襲實驗.用棉簽擦除聚碳酸酯膜上表面的細胞,并將膜下表面的細胞用甲醇固定5 min后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min.用倒置相差顯微鏡隨機選取5個視野的細胞圖像,并對染色的細胞計數(shù).

1.2.5 LC3Ⅱ免疫熒光染色:將SW480細胞接種在24孔板(2.0×105個/孔),用不同濃度PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理24 h后,收集細胞并用4%多聚甲醛固定20 min,然后在室溫下用Triton X-100透化15 min.用5%BSA封閉細胞30 min,然后室溫孵育LC3Ⅱ(1:300)2 h.用PBS洗滌細胞后,室溫孵育熒光標(biāo)記的二抗(1:300)1 h.再次用PBS洗滌后,用DAPI染核,并在熒光顯微鏡下觀察.

1.2.6 Western blot:收集已被0、5、10、20 μg/mL PIP處理24 h的SW480細胞,并用RIPA緩沖液裂解細胞分離得到總蛋白.用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度.將等量蛋白質(zhì)經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上.用5%脫脂牛奶封閉2 h后,分別4 ℃孵育一抗LC3、p53、Bax、Bcl-2和Cleaved caspase 3(均1:1000稀釋比例)和β-Actin(1:5000稀釋比例)過夜,經(jīng)TBS洗滌3次后,室溫孵育1:2000稀釋比例的HRP特異性標(biāo)記的二抗2 h,最后使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑對條帶顯影.使用Image J軟件對條帶進行定量.

統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均以mean±SD表示,并應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析.多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析,多重比較使用Tukey法.以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 PIP抑制SW480和HT-29細胞的細胞活性并誘導(dǎo)其發(fā)生形態(tài)異常 用濃度梯度遞增的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理SW480和HT-29細胞24 h,CCK-8結(jié)果表明,PIP處理的細胞活性顯著降低并呈劑量依賴性(圖1A、B),且在PIP濃度達到20 μg/mL時效果最顯著.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果表明,PIP處理后的SW480細胞形態(tài)萎縮變圓,且隨著濃度增加,細胞密度也逐漸降低(圖1C),同樣,當(dāng)PIP濃度達到20 μg/mL時出現(xiàn)明顯的細胞碎片和形態(tài)學(xué)改變.另外,在(5、10和20 μg/mL)劑量下的PIP對人正常結(jié)腸粘膜上皮細胞系FHC和NCM460的細胞活性沒有影響(圖2),提示在該劑量下PIP對正常細胞無毒.由此可見,PIP能抑制結(jié)腸癌細胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡.

圖1 PIP對SW480和HT29細胞的細胞活性和細胞形態(tài)的影響.A和B:CCK-8檢測各組SW480(A)和HT-29(B)細胞的細胞活性;C:倒置顯微鏡觀察各組細胞的細胞形態(tài).n=3,aP＜0.01,bP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

圖2 PIP對FHC和NCM460細胞的細胞活性的影響.A和B:CCK-8檢測各組FHC(A)和NCM460(B)細胞的細胞活性.n=3.PIP:胡椒堿.

2.2 PIP抑制SW480細胞的增殖 用濃度梯度遞增的PIP(0、5、10、20 μg/mL)處理SW480細胞24 h,EdU染色(圖3)結(jié)果顯示,隨著PIP濃度逐漸升高,EdU陽性細胞比例逐漸降低,提示SW480細胞增殖逐漸降低,且PIP在濃度為20 μg/mL時對細胞增殖的抑制作用最為明顯.

圖3 PIP對SW480細胞增殖的影響.A:各組細胞代表性的EdU染色圖;B:各組EdU陽性細胞比例的統(tǒng)計結(jié)果.n=3,aP＜0.05,bP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

2.3 PIP抑制SW480細胞遷移和侵襲 Transwell結(jié)果(圖4)顯示,隨著PIP濃度的升高,細胞的遷移能力和侵襲能力均呈濃度依賴性減弱,且PIP在濃度為20 μg/mL時對細胞遷移與侵襲的抑制作用最為明顯.

圖4 PIP對SW480細胞的遷移和侵襲的影響. A:各組細胞代表性的遷移與侵襲圖(Transwell法,結(jié)晶紫染色,比例尺=200 μm).B:細胞遷移的統(tǒng)計結(jié)果;C:細胞侵襲的統(tǒng)計結(jié)果.n=3,aP＜0.01,bP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

2.4 PIP誘導(dǎo)SW480細胞自噬并上調(diào)p53信號通路LC3Ⅱ的免疫熒光染色結(jié)果(圖5A)顯示,PIP能誘導(dǎo)SW480細胞自噬.Western blot結(jié)果(圖5B-G)顯示,隨PIP濃度升高,SW480細胞中p53、Bax和Cleaved caspase 3表達以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值逐漸增加,Bcl-2表達逐漸降低.以上結(jié)果說明,PIP能誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生自噬性死亡并上調(diào)p53信號.

圖5 PIP對SW480細胞的自噬以及p53信號通路的影響.A:各組細胞代表性的LC3Ⅱ免疫熒光染色圖;B:各組細胞代表性的p53、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase 3以及LC3蛋白表達的Western blot條帶圖;C:p53相對表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;D:Bcl-2相對表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;E:Bax相對表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;F:Cleaved caspase 3相對表達水平的統(tǒng)計結(jié)果;G:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的統(tǒng)計結(jié)果.n=3,aP＜0.01,bP＜0.01,cP＜0.01,dP＜0.05,eP＜0.01,fP＜0.01,gP＜0.01 vs 0 μg/mL組.PIP:胡椒堿.

3 討論

結(jié)腸癌是臨床中十分常見的一種發(fā)病率和死亡率均居高不下的惡性腫瘤性疾病[1,2],據(jù)報道,全球每年約新增120萬例,且每年約60萬例因結(jié)腸癌而死亡[9].目前手術(shù)切除輔以術(shù)后化療是結(jié)腸癌治療中的最常用策略,但隨著化療時間的延長,腫瘤細胞對化療藥物的敏感性降低,造成患者對化療藥物耐藥性的產(chǎn)生從而阻礙治療進程[3].因我國傳統(tǒng)中藥具有藥理活性豐富、治療靶點多、且毒副作用相對較低的特性,其在腫瘤治療方面的應(yīng)用中也受到越來越多的關(guān)注[5].從眾多傳統(tǒng)中藥中篩選具有高活性的抗腫瘤小分子可能會成為篩選新型抗癌藥物的潛在途徑.PIP作為一種從黑胡椒內(nèi)提取的具有天然活性的生物堿,其已被一些臨床前研究證明具有抗腫瘤活性[6,7].本研究顯示,PIP能抑制SW480細胞增殖、遷移與侵襲,提示其有望成為抗結(jié)腸癌的潛在的替代藥物.

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細胞的自噬異常存在密切的關(guān)系[10,11].適度自噬可作為實體腫瘤細胞在對抗缺氧缺營養(yǎng)的不利條件下而發(fā)揮促生存的一種保護機制,但過度自噬則會抑制腫瘤細胞的活性、增殖、遷移與侵襲并最終導(dǎo)致細胞死亡[12].研究表明,伊立替康、奧沙利鉑和5-FU等常見的化療藥物均能導(dǎo)致結(jié)腸癌細胞自噬性死亡[13,14].因此,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬性死亡已經(jīng)成為潛在的抗結(jié)腸癌治療策略之一.故本研究探索PIP對SW480細胞自噬的影響,結(jié)果顯示,PIP能增強SW480細胞的LC3Ⅱ的免疫熒光強度并增加LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Cleaved caspase 3表達,說明PIP能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬性細胞死亡,提示PIP的抗結(jié)腸癌的作用至少部分與其誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞自噬性細胞死亡相關(guān).

本研究繼續(xù)對PIP的抗結(jié)腸癌的作用機制進行了探索.已有研究表明,p53可通過上調(diào)下游基因p21表達導(dǎo)致G1期阻滯[15]和下調(diào)Cyclin B1導(dǎo)致G2/M期阻滯[16],從而抑制結(jié)腸癌細胞增殖;p53也可通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2的表達來達到促進結(jié)腸癌細胞凋亡的作用[17].另外,p53能通過下游多信號通路來抑制結(jié)腸癌細胞的遷移與侵襲[18,19].本研究發(fā)現(xiàn),PIP能濃度依賴性抑制SW480增殖、遷移與侵襲的同時伴隨著上調(diào)p53、Bax和Cleaved Caspase 3表達并下調(diào)Bcl-2的表達,提示PIP抑制細胞增殖、遷移與侵襲可能在一定程度上與其上調(diào)p53信號通路相關(guān).而p53與細胞自噬的關(guān)系相對復(fù)雜,一方面核p53可通過發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用促進細胞自噬[20],另一方面漿p53以轉(zhuǎn)錄活性非依賴性抑制自噬[21].此外,一些毒性應(yīng)激(比如某些化療藥物)和氧化應(yīng)激刺激時,結(jié)腸癌細胞自噬也可不依賴p53發(fā)生自噬性細胞死亡[13].因此,PIP誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生自噬性細胞死亡是否通過p53信號仍需進一步研究.

4 結(jié)論

總之,本研究目前結(jié)果顯示,PIP能抑制SW480細胞增殖、遷移和侵襲,其作用機制可能與其誘導(dǎo)SW480細胞自噬性細胞死亡和上調(diào)p53信號通路相關(guān).本研究結(jié)果還提示,PIP是潛在的結(jié)腸癌治療劑.

文章亮點

實驗背景

由于常用的化療藥物具有較高的毒副作用,且易產(chǎn)生化療耐藥,造成目前結(jié)腸癌患者的化療效果并不太理想.因此,尋找新型高效低毒的結(jié)腸癌化療替代藥物顯得尤為迫切.

實驗動機

據(jù)最近研究顯示胡椒堿(piperine,PIP)在多種腫瘤中具有抗癌作用,但其在結(jié)腸癌的作用和機制的評估尚不完善.

實驗?zāi)繕?biāo)

探討PIP是否具有抗結(jié)腸癌的作用.

實驗方法

分別通過細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)法、5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色法和Transwell法檢測PIP對SW480細胞增殖、遷移以及侵襲的影響,并用免疫熒光法和蛋白質(zhì)免疫印跡法分析其潛在的機制.

實驗結(jié)果

PIP在0-20 μg/mL濃度范圍內(nèi)能以劑量依賴性方式抑制SW480細胞增殖、遷移和侵襲,并上調(diào)細胞中p53表達和誘導(dǎo)其自噬性死亡相關(guān).另外,在此劑量范圍內(nèi)對結(jié)腸癌上皮細胞無毒性.

實驗結(jié)論

PIP具有抗結(jié)腸癌的作用,這一作用體現(xiàn)在PIP能抑制結(jié)腸癌增殖、遷移和侵襲并能誘導(dǎo)其自噬性死亡.

展望前景

PIP是潛在的結(jié)腸癌常用化療藥的替代藥物.