劉 英，唐小涓，劉靜靜，張雯瑾，賴泓江，李德龍，2*

（1. 西南大學動物醫(yī)學院，重慶402460；2. 西南大學醫(yī)學研究院免疫學研究中心，重慶402460）

鴨疫里默氏菌（Riemerellaanatipestifer）是嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疫病之一，極易感染2~3周齡雛鴨[1-3]。鴨感染鴨疫里默氏菌后以嚴重肝損傷為主要特征，表現(xiàn)為典型的纖維素性肝包炎、內(nèi)皮細胞損傷、血管通透性增加。內(nèi)皮細胞是血管壁的重要組成部分，在調(diào)節(jié)血流、血小板激活、白細胞黏附等過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。內(nèi)皮細胞功能障礙是多種滲出性炎癥發(fā)生過程中的促進因素，因此分離得到鴨肝竇內(nèi)皮細胞對研究R.anatipestifer 致病機制有重大意義。Ⅷ因子常用來鑒定肝竇內(nèi)皮細胞。但是，目前Ⅷ因子相關試劑和試劑盒主要集中在人或小鼠上，市面上缺乏鴨Ⅷ因子的相關試劑。因此，本研究擬制備鴨凝血因子Ⅷ多克隆抗體，為后續(xù)鴨肝竇內(nèi)皮細胞鑒定提供試驗材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

6~8周齡試驗小鼠購自西南醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 試劑

HRP 標記的山羊抗鼠IgG 購自Sigma 公司；DNA Ligation Kit、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒等購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鴨Ⅷ因子克隆與分析

根據(jù)NCBI 鴨Ⅷ因子序列（GenBank 登錄號XM_027465529.1）設計6 對引物，分段擴增Ⅷ-1、Ⅷ-2、Ⅷ-3、Ⅷ-4、Ⅷ-5和Ⅷ-6，并設計相應引物，見表1。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

雛鴨放血處死后，采集肝臟，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后 PCR 擴增。反應條件：94 ℃ 4 min，（94 ℃ 30 s，52~55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min）×35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將回收的目的片段與T-載體連接，轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α，涂布LB 平板（Amp+），挑取單菌落，搖菌后提取質(zhì)粒，鑒定正確后送武漢金開瑞生物工程有限公司測序，并利用生物學軟件進行分析。

表1 鴨Ⅷ因子各基因片段引物序列Tab.1 The primer sequences of each gene fragment of duck factor Ⅷ

1.2.2 重組蛋白的誘導表達

根據(jù)抗原表位軟件對鴨Ⅷ因子進行分析，發(fā)現(xiàn)其主要抗原表位位于C端，另依據(jù)E.coli最適密碼子進行合成，即Ⅷ-C（m）。以pET-32a(+)構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-Ⅷ-C(m)，轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3），挑菌，37 ℃ 搖菌至OD≈0.8；IPTG（1.0 mmol/L）誘導后離心，PBS重懸，菌體經(jīng)超聲破碎后離心，收集上清和沉淀，進行12%SDS-PAGE。

1.2.3 免疫抗原制備

Ⅷ-C（m）經(jīng)SDS-PAGE分離，切取凝膠條帶，烘干，研磨，加0.9%生理鹽水充分勻漿，制備免疫抗原。

1.2.4 多克隆抗體制備

將16 只小鼠隨機分為2 組，每組8 只，分別皮下注射Ⅷ-C（m）和0.1 mL PBS。以相同劑量加強免疫2 次，每次加強免疫間隔14 d。試驗結(jié)束后處死小鼠，分離血清備用。

1.2.5 多克隆抗體效價檢測

將Ⅷ-C（m）用pH 值9.6 碳酸鹽緩沖液稀釋（5 mg/L），4 ℃過夜；5%脫脂奶粉封閉，37 ℃孵育2 h；鼠抗Ⅷ-C（m）血清，37 ℃孵育 1 h；HRP 標記山羊抗鼠 IgG，37 ℃孵育1 h；TMB避光顯色15 min，2 mol/L H2SO4終止反應。判定標準：S/N=（樣品OD450）（/陰性對照OD450），S/N>2.1 為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ⅷ-C克隆與序列分析（見圖1）

由圖 1 可知，PCR 擴增后得到 1 個 993 bp 的片段，經(jīng)NCBI BLAST 比 對 ，與 鴨 Ⅷ（GenBank 登 錄 號 XM_027465529.2）的相似性為99.39%。結(jié)果顯示，成功獲得Ⅷ-C基因。

圖1 Ⅷ-C基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of Ⅷ-C gene

2.2 重組蛋白的檢測（見圖2）

由圖2可知，pET-Ⅷ-C(m)/E.coliBL21經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE可檢測到約為54 kDa的重組蛋白，與預期重組蛋白pET-Ⅷ-C（m）大小一致。

圖2 pET-Ⅷ-C（m）/E.coli BL21重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 The analysis of recombinant protein of pET-Ⅷ-C(m)/E.coli BL21 by SDS-PAGE

2.3 免疫抗原制備（見圖3）

圖3 pET-Ⅷ-C（m）/E.coli BL21切膠純化制備免疫抗原Fig.3 Preparation of immune antigen of pET-Ⅷ-C(m)/E.coli BL21 by gel purification

由圖3 可知，切取Ⅷ-C（m）條帶，烘干，研磨，使用0.9%生理鹽水充分勻漿，制備免疫抗原。

2.4 鼠抗C4BPα(m)多克隆抗體ELISA結(jié)果（見表2）

由表2 可知，多克隆抗體在稀釋度1∶104S/N 均大于2.1，因此鑒定為陽性，同時效價大于1∶104，但小于 1∶105。

表2 鼠抗C4BPα（m）多克隆抗體ELISA結(jié)果Tab.2 Detection of polyclonal antibodies of mouse anti-C4BPα(m)by ELISA

3 討論

R.anatipestifer 主要危害2~8 周齡雛鴨，給我國養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-3]。鴨傳染性漿膜炎以纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為主，在纖維素性滲出物中有多量炎性細胞浸潤，主要是異嗜性粒細胞和巨噬細胞[6-9]。目前，R.anatipestifer 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)21 個血清型，并且隨著研究的深入，新的血清型也不斷出現(xiàn)[10-12]。R.anatipestifer 各血清型菌株間交叉免疫保護較差，因此疫苗免疫效果不佳。R.anatipestifer 極易產(chǎn)生耐藥性，一旦發(fā)病，抗生素治療作用不明顯[13-16]。因此，只有盡快闡明其致病機制，才能找到新的防治措施。R.anatipestifer 感染主要引起廣泛性的纖維素性滲出性炎癥，而滲出性炎癥發(fā)生的病理學基礎在于血管內(nèi)皮細胞損傷，致使血管通透性增加。另外，R.anatipestifer 感染主要引起雛鴨嚴重肝損傷，以纖維素性肝周炎為主，同時伴有肝索結(jié)構(gòu)紊亂、肝細胞變性壞死、肝竇擴張淤血等病理變化。因此，闡明R.anatipestifer感染致肝竇內(nèi)皮細胞的機制尤為重要。分離肝竇內(nèi)皮細胞后需要進行鑒定，而Ⅷ因子多抗常被用來鑒定肝竇內(nèi)皮細胞。但是，目前Ⅷ因子相關試劑和試劑盒主要集中在人或小鼠上，市面上缺乏鴨Ⅷ因子的相關試劑。因此，本研究通過制備鴨Ⅷ因子多抗，為鑒定鴨肝竇內(nèi)皮細胞提供試驗材料。

Ⅷ因子分子量較大，因此直接表達后進行純化難度較大。本研究根據(jù)抗原表位預測軟件對鴨Ⅷ因子全基因組序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其抗原表位主要位于C 端。因此，對鴨ⅧC端（Ⅷ-C）進行密碼子優(yōu)化、原核表達，免疫小鼠制備多抗，并測定其效價。另外，在制備小鼠免疫抗原時，應用切膠純化，操作方便、成本低，同時獲得的多抗效價大于1∶104，說明多克隆抗體制備成功，可以滿足后續(xù)試驗需要。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，成功擴增出Ⅷ-C基因；SDS-PAGE可檢測到約為54 kDa的Ⅷ-C（m）重組蛋白；ELISA檢測多抗效價>1∶104。本研究為后續(xù)鴨肝竇內(nèi)皮細胞鑒定提供試驗材料。