茹元樸,陳君,張明輝,喬為倉(cāng),趙軍英,侯俊財(cái),陳樹(shù)興*,陳歷俊*

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽(yáng),471023) 2(北京三元食品股份有限公司 國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京市乳品工程技術(shù)研究中心,母乳研究技術(shù)創(chuàng)新中心,北京,100163) 3(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

唾液酸(sialic acids,SA)，又稱(chēng)神經(jīng)氨酸，是一類(lèi)含有9碳的酸性氨基糖[1]，主要在糖蛋白和糖脂的末端以短鏈殘基的形式存在[2]。唾液酸廣泛分布于自然界各種生物體中，在哺乳動(dòng)物的腦、乳、血液和神經(jīng)組織黏蛋白中含量較高[3]，積極參與體內(nèi)蛋白水解保護(hù)、細(xì)胞識(shí)別、生殖、感染、免疫和認(rèn)知發(fā)育等生物學(xué)作用[4]。

母乳中含量豐富的唾液酸，對(duì)嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及抵抗腸道感染發(fā)揮重要作用[5]。當(dāng)母乳不足時(shí)，嬰兒配方粉成為母乳主要的替代品。然而嬰兒配方粉中的唾液酸在含量、種類(lèi)以及結(jié)構(gòu)方面與母乳差異較大[6]，有研究表明，母乳喂養(yǎng)的嬰兒在認(rèn)知發(fā)育方面的總體得分高于嬰兒配方奶粉喂養(yǎng)。為了更好地匹配母乳成分，嬰兒配方奶粉已經(jīng)將唾液酸作為奶粉優(yōu)化的參數(shù)之一[7]。

唾液酸的檢測(cè)方法主要有分光光度法[8]、高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜法[11]、質(zhì)譜分析法[12-13]和核磁共振法等[11]。分光光度法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單快捷，但不能區(qū)分唾液酸的結(jié)構(gòu)，且對(duì)樣品的純度要求較高；高效液相色譜法和氣相色譜法都需要衍生處理，實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用靈敏度高，不需要衍生，然而回收率較差；核磁共振法的樣品需求量大且靈敏度較差，更適合對(duì)唾液酸的定性[11]。

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法(high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD)主要用于糖類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)。此方法不需要衍生、操作簡(jiǎn)單、具有良好的選擇性、靈敏度較高且環(huán)境友好，適用于乳源唾液酸的檢測(cè)。TANG等[14]采用HPAEC-PAD法對(duì)牛乳及制品中的Neu5Ac和Neu5Gc同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，但該方法不能適用于嬰兒配方粉中唾液酸的檢測(cè)，因?yàn)閶雰号浞椒壑泻械碾s質(zhì)化合物會(huì)干擾唾液酸的離子峰圖。有報(bào)道采用離子色譜法測(cè)定母乳中游離唾液酸[15]，但還未應(yīng)用于母乳中總唾液酸的檢測(cè)，目前,能同時(shí)應(yīng)用于母乳和嬰兒配方粉中唾液酸的檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用酸水解法提取不同結(jié)合形態(tài)中的唾液酸，使用離子色譜前處理柱純化嬰兒配方粉水解液，建立了高效陰離子色譜-脈沖安培法測(cè)定母乳和嬰兒配方粉中Neu5Ac和Neu5Gc的方法，并應(yīng)用該方法測(cè)定不同泌乳期母乳及不同階段市售嬰兒配方粉中唾液酸的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Dionex ICS-6000離子色譜、Dionex CarboPac PA20分析柱(3 mm×150 mm，填料：樹(shù)脂)、Dionex CarboPac PA20保護(hù)柱(3 mm×30 mm，填料：樹(shù)脂)，Thermo Scientific公司；Cleanert IC-A前處理小柱(1cc 50/pkg)、0.22 μm濾膜，Agela公司；Milli-Q.A10超純水凈化器，美國(guó)MILLIPORE公司；3K-15高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；Polystat K6恒溫水浴鍋，德國(guó)Huber公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 樣品與試劑

母乳(初乳、過(guò)渡乳、成熟乳),北京三元食品股份有限公司國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心提供；嬰兒配方奶粉(Ⅰ段、Ⅱ段、Ⅲ段),各大超市；N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac,色譜純,純度≥97%)、醋酸鈉,Sigma公司；N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Gc,色譜純,純度≥98.2%),源葉生物；NaOH、甲酸、H2SO4、鹽酸、三氟乙酸、三氯乙酸,均為分析純,Fisher Scientific公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱(chēng)取一定質(zhì)量的標(biāo)品,將Neu5Ac溶于超純水中,Neu5Gc分別溶于超純水和50 mmol/L NaCl溶液,并按表1中的質(zhì)量濃度配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中Neu5Ac和Neu5Gc的質(zhì)量濃度Table 1 Mass concentrations of Neu5Ac and Neu5Gc in standard series working solutions

1.4 樣品前處理

母乳和嬰兒配方粉樣品的前處理過(guò)程如圖1所示。

圖1 樣品前處理流程圖Fig.1 Flow chart of sample pretreatment

1.4.1 母乳

吸取200 μL母乳于離心管中,加入200 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白,混勻后冰浴10 min,在4 ℃、3 000 r/min條件下離心30 min。將上清液移入新的離心管,于沉淀中加入500 μL冷的5%的三氯乙酸溶液洗滌,充分混勻后繼續(xù)在4 ℃、3 000 r/min條件下離心30 min,吸取上清液到第1次的上清液中。合并上清液并加入1 mL 0.1 mol/L三氟乙酸溶液80 ℃水解30 min。將處理后的沉淀中加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)0.1%鹽酸,80 ℃水解 75 min,取出后冷卻至室溫。將2組水解液混合,用超純水定容至10 mL,混勻。吸取1 mL母乳定容液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液按色譜條件分析。

1.4.2 嬰兒配方粉

精確稱(chēng)量1 g奶粉于10 mL超純水中,加熱至50 ℃,使奶粉充分溶解。按1.4.1的方法對(duì)復(fù)溶嬰兒配方粉進(jìn)行處理,并定容至10 mL進(jìn)行純化。首先將Cleanert IC-A小柱用10 mL超純水活化,靜置10 min,然后加入1 mL奶粉定容液。用5 mL的超純水清洗,以去除樹(shù)脂中任何未帶電的殘余化合物。最后用5 mL的50 mmol/L NaCl溶液將結(jié)合在樹(shù)脂上的唾液酸洗脫下來(lái)。吸取1 mL洗脫液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜,濾液按色譜條件分析。

1.5 色譜條件

采用CarboPac PA20(3 mm×150 mm)分析柱,Dionex CarboPac PA20(3 mm×30 mm)保護(hù)柱,ED6000脈沖安培檢測(cè)器,Au工作電極,Ag/AgCl參比電極,糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形。柱溫30 ℃,檢測(cè)器溫度30 ℃,流速0.5 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL,以A:超純水、B:1 mol/L醋酸鈉、C:200 mmol/L NaOH為淋洗液進(jìn)行梯度洗脫,洗脫程序如表2所示。

表2 梯度洗脫程序表Table 2 Gradient elution procedure

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

CarboPac PA20色譜柱具有柱容量小、能分離常見(jiàn)的單糖和多糖等特點(diǎn),更加適合分離保留性較強(qiáng)和復(fù)雜基質(zhì)的化合物。在CarboPac PA20柱上等度洗脫和梯度洗脫對(duì)Neu5Ac和Neu5Gc的影響如圖2所示,采用50 mmol/L的醋酸鈉和100 mmol/L NaOH溶液對(duì)2種標(biāo)品進(jìn)行等度洗脫,發(fā)現(xiàn)此時(shí)Neu5Ac的響應(yīng)值高且分離度達(dá)到4.51,但Neu5Gc的響應(yīng)值和分離度過(guò)低(圖2-a)。而采用20～300 mmol/L的醋酸鈉和100 mmol/L NaOH溶液在5～15 min進(jìn)行梯度洗脫時(shí)(圖2-b),發(fā)現(xiàn)Neu5Gc的響應(yīng)值高,分離度達(dá)到3.43,但Neu5Ac的分離度卻又降低,且基線不穩(wěn)定。結(jié)合這2種洗脫方法,不斷優(yōu)化,最終的梯度洗脫程序如表2所示。離子流圖如圖2-c所示,此時(shí)的峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)性好、基線穩(wěn)定、響應(yīng)值和分離度都高,更有利于含量較低的Neu5Gc的檢測(cè)和定量。

a-等度洗脫；b-梯度洗脫1；c-梯度洗脫2；1-Neu5Ac;2-Neu5Gc圖2 不同洗脫程序的離子流圖Fig.2 Ion flow diagram of different elution procedures

2.2 樣品前處理優(yōu)化

2.2.1 酸水解時(shí)間優(yōu)化

唾液酸在母乳中主要與低聚糖結(jié)合,而在嬰兒配方粉中主要與蛋白質(zhì)結(jié)合,再加上母乳和嬰兒配方粉含有大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化合物復(fù)雜基質(zhì),使得乳中唾液酸的檢測(cè)極具挑戰(zhàn)性[10]。為了能夠更好地檢測(cè)唾液酸的含量,一般通過(guò)化學(xué)水解法將唾液酸從結(jié)合態(tài)中釋放出來(lái)。

酸水解法是目前應(yīng)用最廣泛的方法,通過(guò)溫和的酸加熱樣品至70～90 ℃實(shí)現(xiàn)水解。由于唾液酸在乳品中存在不同的結(jié)合形式,有研究通過(guò)離心分離低聚糖和蛋白,然后采用不同的水解條件對(duì)唾液酸進(jìn)行處理,從而達(dá)到更好的水解效果[16]。LACOMBA等[17]對(duì)不同水解酸(稀鹽酸、三氟乙酸、稀硫酸、乙酸)進(jìn)行了比較研究,結(jié)果顯示稀鹽酸和三氟乙酸的水解效果最好。本研究在此基礎(chǔ)上以母乳為對(duì)象,分別考察了鹽酸對(duì)沉淀部分(蛋白結(jié)合唾液酸)和三氟乙酸對(duì)上清液部分(低聚糖結(jié)合唾液酸)水解時(shí)間的影響。如圖3所示,鹽酸在75 min時(shí)對(duì)蛋白結(jié)合唾液酸的釋放效果最好,而低聚糖結(jié)合唾液酸在30 min時(shí)水解效果最佳。

a-低聚糖結(jié)合唾液酸；b-蛋白結(jié)合唾液酸;a對(duì)應(yīng)左側(cè)縱坐標(biāo);b對(duì)應(yīng)右側(cè)縱坐標(biāo)圖3 唾液酸水解時(shí)間曲線Fig.3 Hydrolysis time curve of sialic acids

2.2.2 嬰兒配方粉純化條件優(yōu)化

考察了不同濃度NaCl溶液(30、40、50、60、70、80 mmol/L)對(duì)唾液酸洗脫回收率的影響,由圖4可知,50 mmol/L NaCl溶液洗脫唾液酸的效果最好。然而由于奶粉樣品中增加了一定濃度的NaCl溶液,導(dǎo)致Neu5Gc的平均保留時(shí)間從13.916 min提前至13.666 min,HURUM等[9]的解決方案是繼續(xù)對(duì)洗脫液進(jìn)行1∶2.5倍的稀釋,通過(guò)稀釋NaCl的濃度來(lái)消減其產(chǎn)生的影響。然而此方法會(huì)導(dǎo)致待測(cè)樣品中Neu5Gc的含量過(guò)低,從而影響樣品檢測(cè)。與此方法相比,本文通過(guò)將Neu5Gc溶于50 mmol/L NaCl溶液的方法來(lái)消除實(shí)驗(yàn)誤差,能夠?qū)兓蟮哪谭蹣悠愤M(jìn)行更加精準(zhǔn)的檢測(cè)。

圖4 不同濃度NaCl溶液對(duì)唾液酸洗脫回收率的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NaCl solution on the elution recovery rate of sialic acid

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性

在1.5條件下,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)樣檢測(cè),以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。如表3所示,Neu5Ac質(zhì)量濃度在0.1～10 mg/L,與峰面積的線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9,此線性范圍適合檢測(cè)奶粉中Neu5Ac；由于母乳在不同泌乳期唾液酸的總量差別較大,因此需要用更大的線性范圍進(jìn)行校正。Neu5Ac在線性范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均>0.999,各組分保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均<0.97%。

表3 Neu5Ac和Neu5Gc的線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Linear range and standard curve of Neu5Ac and Neu5Gc

2.3.2 精密度

取30 mg/L的Neu5Ac和1 mg/L的Neu5Gc標(biāo)品溶液按1.5條件連續(xù)進(jìn)樣6次,離子峰面積RSD分別為1.26%和0.99%,表明此方法精密度良好。

2.3.3 檢出限和定量限

取一定濃度的Neu5Ac和Neu5Gc標(biāo)品溶液,加水逐級(jí)稀釋,結(jié)果表明Neu5Ac的檢出限為3 μg/L,定量限為10 μg/L；Neu5Gc的檢出限為2 μg/L,定量限為6 μg/L,更適用于唾液酸的檢測(cè)。該方法與陳海嬌等[10]建立的液相色譜法相比,具有更低的檢出限，更適用于唾液酸的檢測(cè),尤其是針對(duì)含量較低于Neu5Gc。

2.3.4 重復(fù)性

按1.4實(shí)驗(yàn)條件對(duì)母乳和嬰兒配方粉進(jìn)行前處理,并按1.5色譜條件對(duì)其唾液酸含量進(jìn)行檢測(cè),每組實(shí)驗(yàn)6個(gè)平行。母乳樣品中Neu5Ac的RSD為4.51%,嬰兒配方粉樣品中Neu5Ac和Neu5Gc的RSD分別為1.1%和5.22%,說(shuō)明該檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性

分別取1份母乳和嬰兒配方粉樣品,按1.4實(shí)驗(yàn)條件處理后,分別在0、2、4、6、8、24、48、72、96 h上機(jī)檢測(cè),平行測(cè)定3次,取其平均值。測(cè)得的樣品含量如圖5所示,樣品各組分含量隨時(shí)間增長(zhǎng)逐漸減少,樣品8 h的RSD均<2.4%,檢測(cè)了4 d的日間穩(wěn)定性,其RSD均<5.21%,結(jié)果表明樣品可以在較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定。

a-日內(nèi)穩(wěn)定性；b-日間穩(wěn)定性；1-母乳Neu5Ac；2-嬰兒配方粉Neu5Ac；3-嬰兒配方粉Neu5Gc圖5 母乳與嬰兒配方粉樣品中唾液酸的日內(nèi)和日間穩(wěn)定性Fig.5 Intraday and inter-day stability of sialic acid in the samples of human milk and infant formula

2.3.6 加標(biāo)回收率

取母乳和嬰兒配方粉樣品,分別按表4加入低、中、高濃度的標(biāo)品,測(cè)定唾液酸含量,平行測(cè)定3次,取其平均值,計(jì)算回收率。各組分RSD均<2.65%,回收率在87.65%～102.33%,說(shuō)明該方法具有良好的回收率。

表4 母乳和嬰兒配方粉樣品加標(biāo)回收率Table 4 Spiked recoveries of milk and infant formula samples

2.3.7 樣品分析

分別取3個(gè)母親(A、B、C)的初乳、過(guò)渡乳和成熟乳,3個(gè)市售品牌(D、E為牛乳基嬰兒配方粉,F為羊乳基嬰兒配方粉)的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段嬰兒配方粉,按照建立的方法進(jìn)行唾液酸檢測(cè),每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,以繪制的標(biāo)準(zhǔn)校正曲線進(jìn)行定量。

由表5可知,母乳各階段的唾液酸含量在483.534～1 595.897 mg/L,隨著泌乳期的增加,母乳中唾液酸含量逐漸減少(P<0.05),這與CLAUMARCHIRANT等[19]的報(bào)道一致,表明該方法具有較大的濃度檢測(cè)范圍。值得注意的是,由于本方法的檢出限低,能夠在部分母乳樣本中檢測(cè)到Neu5Gc,但人體本身不產(chǎn)生Neu5Gc,因這可能與人食用含有Neu5Gc的食物有關(guān),如雞蛋、紅肉和乳制品等[20],LACOMBA[17]和QUIN等[21]的報(bào)道也支持該觀點(diǎn)。不同品牌和不同階段嬰兒配方粉中的唾液酸含量差異較大,這與配料以及各階段嬰兒配方粉的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。其中,羊乳基嬰兒配方粉中Neu5Gc的含量高達(dá)54.85 mg/100 g,顯著高于牛乳基嬰兒配方粉中的含量(P<0.05)?，F(xiàn)有的奶粉檢測(cè)方法大多只針對(duì)Neu5Ac，而本方法Neu5Gc的定量限為6 μg/L，能夠?qū)ζ錅?zhǔn)確定量。文獻(xiàn)中報(bào)道的牛乳基嬰兒配方粉中Neu5Ac和Neu5Gc的含量分別在71～389 和3.8～5.5 mg/100g之間，本研究檢測(cè)結(jié)果也與文獻(xiàn)中報(bào)道的一致[8-9,16-21]，但未在其他文獻(xiàn)中找到有關(guān)羊乳基嬰兒配方粉唾液酸含量的報(bào)道。

3 結(jié)論

采用高效陰離子色譜-脈沖安培檢測(cè)法建立了能同時(shí)應(yīng)用于母乳和嬰兒配方粉中唾液酸的檢測(cè)方法,通過(guò)離子色譜前處理柱純化唾液酸樣品,能夠有效減少樣品中的雜質(zhì),更適用于基質(zhì)復(fù)雜的唾液酸樣品檢測(cè)。與傳統(tǒng)的液相色譜法相比,該方法不需要衍生,操作簡(jiǎn)單,具有較好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。該方法的精密度高、檢出限低、檢測(cè)范圍廣,能夠廣泛應(yīng)用于不同泌乳期的母乳及嬰兒配方粉中唾液酸的定量分析。