喬榮更,賈宇,張紅星*,謝遠紅,金君華,劉慧,蔣林樹,郝彥玲

1(食品質(zhì)量與安全北京實驗室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室,北京農(nóng)學院 食品科學與工程學院,北京,102206) 2(中國農(nóng)業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京,100083)

人體口腔環(huán)境是由多種屬微生物形成的復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)[1],口腔中細菌的種類超過700種,微生物通過共生、競爭和拮抗等相互作用影響著口腔的微生態(tài)平衡,與宿主口腔健康和疾病有著緊密聯(lián)系[2]。當有外來微生物進入口腔環(huán)境或者口腔環(huán)境中固有的某些微生物過量生長,逐漸成為優(yōu)勢菌群時,會打破口腔的微生態(tài)平衡,導(dǎo)致口腔疾病發(fā)生[1]。人類常見的口腔感染性疾病包括牙周病、齲齒和口臭等,對人體健康造成危害。目前,普遍認為牙周疾病主要由牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、具核梭桿菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌等革蘭氏陰性厭氧菌聯(lián)合致病[3]。齲病主要是以變異鏈球菌和產(chǎn)酸菌的過度生長引起的牙體硬組織感染性疾病[4]?？谇荒钪榫∈悄钪榫鷮俑腥疽鸬目谇火つぜ膊?其中白色念珠菌是最主要的病原菌[5]。

目前,國內(nèi)外主要采用口服抗生素的化學療法來治療細菌感染性疾病。但長期服用抗生素會破壞口腔生態(tài)系統(tǒng)平衡,同時也加劇了細菌耐藥性[6]。而益生菌療法則為口腔疾病提供了新的診治方式[7]。當前國外在口腔醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用益生菌療法方面已有一些研究和嘗試,而國內(nèi)在這方面開展工作較少[8]。

益生菌是指“當攝入適當劑量時對宿主有益的活體微生物制劑”[9]。在口腔中研究和應(yīng)用最多的是乳酸桿菌,但其作用尚不明確[10]。在防治牙周病方面,KOLL-KLAIS等[11]研究指出,口腔環(huán)境中定植的一些乳酸桿菌能夠抑制致病菌牙齦卟啉單胞菌和中間普雷沃菌的生長。在防治齲齒方面,NASE等[12]研究發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌能夠抑制齲齒致病菌變異鏈球菌的生長,減少口腔環(huán)境中變異鏈球菌數(shù)量,降低齲病發(fā)生率。HATAKKA等[13]研究報道益生菌在防治口臭和中老年人口腔念珠菌病等口腔疾病中有顯著療效。綜上所述,益生菌療法可以通過不同的機制抑制致病菌的生長,同時還能維持正常的口腔微生態(tài)菌群,保障口腔健康[14]。本研究篩選具有抑制口腔致病菌的乳酸菌,并研究其抑菌特性,旨在為國內(nèi)口腔益生菌的研究和開發(fā)提供研究思路和經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養(yǎng)基

乳酸菌：篩選自四川大涼山農(nóng)家泡菜；所用培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、MRS+CaCO3篩選培養(yǎng)基、M17液體培養(yǎng)基、M17固體培養(yǎng)基、M17+CaCO3篩選培養(yǎng)基。

表1 指示菌及培養(yǎng)基Table 1 Indicator bacteria and culture medium

1.1.2 主要試劑

MRS培養(yǎng)基制備參見文獻[15]。細菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司；Nisin,浙江新銀象生物工程有限公司；0.22 μm無菌過濾器,德國 Merck Millipore公司；牛津杯(內(nèi)徑6.5 mm,外徑8.0 mm),北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司。

1.1.3 主要儀器

DL-CJ-1 N 超凈工作臺,北京東連哈爾濱儀器制造有限公司；PHS-3B 便攜式酸度計,上海雷磁儀器廠；游標卡尺,杭州易宏制造有限公司；BIOFUGE STRATOS 臺式冷凍離心機,美國 Thermo Scientific；PTC-200 型PCR儀、Bio-RAD 凝膠成像系統(tǒng),美國 Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌的分離

采用涂布平板法[16]：稱取5 g 泡菜樣品放入無菌均質(zhì)袋中,加入45 mL 無菌生理鹽水拍打混勻后,梯度稀釋,分別吸取稀釋倍數(shù)為 10-3、10-4、10-5、10-6的樣品 100 μL,涂布于含2.5% CaCO3的 MRS 和M17平板上,37 ℃培養(yǎng) 24 h。挑取長勢良好,溶鈣圈明顯的菌落,通過平板劃線分離法反復(fù)分離純化,編號，于-80 ℃甘油保藏[17]。

1.2.2 抑制口腔致病菌乳酸菌的篩選

將分離所得乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基活化后,按1×109CFU/mL接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。于4 ℃、10 000×g離心10 min后,棄菌體沉淀,用0.22 μm無菌過濾器過濾得無細胞發(fā)酵上清液。以變異鏈球菌、白色念珠菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌為指示菌,且指示菌的接種濃度均為107CFU/mL、體積均為100 μL,采用牛津杯法[18]篩選出對各指示菌有明顯抑菌圈的菌株。并用MRS液體培養(yǎng)基做陰性對照,質(zhì)量濃度為6.25 mg/mL的Nisin、2 mg/mL山梨酸鉀和納他霉素做陽性對照。每個試驗重復(fù)3次,采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.3 16S rRNA鑒定[19]

根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒說明操作提取未知菌株基因組DNA,以基因組 DNA為模版進行 16S rRNA 基因的 PCR 擴增。擴增引物使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系見表2。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 30 s,34 次循環(huán)；最后 72 ℃延伸 5 min。

表2 PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system

將提取的基因組和 PCR 擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析檢測后,將 PCR 產(chǎn)物進行DNA測序(上海生工生物工程有限公司)。測序序列結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中用 Blast 軟件搜索近似序列,將所測得的序列和從 Gen Bank 中獲得的相關(guān)種屬的16S rRNA 基因序列,運用 Mega 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 乳酸菌SD26不同生長時間上清液pH及抑菌活力的測定

將濃度為1×109CFU/mL的 SD26以2%的體積分數(shù)接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h。每隔 4 h 取培養(yǎng)液 20 mL,測定其OD600。于4 ℃、10 000×g離心10 min后測定上清液的pH及其對白色念珠菌的抑菌活力。設(shè)3個重復(fù),取平均值。

1.2.5 乳酸菌SD26上清液對白色念珠菌生長過程的影響

將濃度為1×109CFU/mL的SD26 以2%的體積分數(shù)接種于200 mL MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h后于4 ℃、10 000×g離心10 min后得上清液,測定上清液的pH值,并將上清液分裝試管編號。用pH計將上清液的pH調(diào)為6.0,然后測定不同pH的SD26發(fā)酵上清液對白色念珠菌生長的影響。

將濃度為1×107CFU/mL的白色念珠菌以2%的體積分數(shù)接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中,編號。再分別添加不同pH的10 mL SD26發(fā)酵上清液,37 ℃培養(yǎng)24 h,每4 h取出一定量培養(yǎng)液,測定其OD600。設(shè)3個重復(fù),繪制白色念珠菌的生長曲線。以不添加SD26上清液的白色念珠菌的生長曲線作為陰性對照。

1.2.6 抑菌物質(zhì)的確定

為了確定乳酸菌SD26發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì),進行以下3種試驗[20-21]:

酸堿作用：測量發(fā)酵上清液的pH,用1 mol/L NaOH溶液或 1 mol/L HCl溶液將發(fā)酵上清液的pH調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0后，分別吸取發(fā)酵上清液和原發(fā)酵上清液,以白色念珠菌為指示菌,用牛津杯法進行抑菌試驗。

酸對照：用乙酸、L-乳酸、D-乳酸將空白的MRS培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到與SD26發(fā)酵上清液相同的pH值,以MRS液體培養(yǎng)基作為空白對照,以白色念珠菌為指示菌,用牛津杯法進行抑菌試驗。

鹽析：取100 mL SD26發(fā)酵上清液,向其中加入硫酸銨至飽和度為75%,待硫酸銨鹽完全溶解,將樣品置于4 ℃中攪拌過夜后10 000×g離心30 min,分別收集上清液和沉淀。測量上清液的pH,并用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為6.0和7.0,用pH 為 7.0的無菌水將沉淀復(fù)溶至 10 mL,取上清液和沉淀復(fù)溶液,以白色念珠菌為指示菌做抑菌試驗。

1.2.7 對食源性常見致病菌抑菌譜的測定

取SD26發(fā)酵上清液,以傷寒沙門氏菌CMCC50071、大腸桿菌ATCC43888、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單核細胞增生李斯特氏菌CMCC54003和單核細胞增生李斯特氏菌CMCC54002為指示菌,且指示菌的接種濃度均為107CFU/mL、體積為100 μL。用牛津杯法[18]做抑菌實驗。每個菌設(shè)3個重復(fù),取平均值。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,數(shù)值均用平均值±標準差來表示,采用Duncan多重比較檢驗,以P>0.05表示差異不著性,P<0.05表示差異顯著。采用Origin 8軟件進行數(shù)據(jù)分析作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 泡菜中乳酸菌的篩選和對口腔致病菌的抑制

從泡菜樣品中篩選分離出9株乳酸菌,編號為 SD23—SD31。9株菌株表現(xiàn)出對不同口腔致病菌的不同抑制作用,由表3可知,SD26對口腔致病菌的抑制作用強于其余菌株。尤其是SD26對白色念珠菌的抑制作用明顯強于其余菌株及對照組Nisin、山梨酸鉀和納他霉素,且SD26對白色念珠菌的抑菌圈直徑最大,為26.63 mm。故選擇SD26菌株作為目標菌株做進一步的試驗研究。

表3 不同菌株對各指示菌的抑制活性Table 3 Inhibitory activity of lactic acid bacteria against different indicators

2.2 乳酸菌SD26的16S r RNA序列分析

圖1為 SD26 的基因組和 16S rRNA 擴增片段。16S rRNA 測序結(jié)果經(jīng)BLAST 分析和多重比對后,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)。由同源性比較可知菌株SD26與植物乳桿菌(L.plantarum)16S rRNA基因序列相似性為 98%,當16S rRNA 序列同源性≥98%時可以認為是同種[22],由此可知菌株SD26為植物乳桿菌。

M1-Marker DL15000 ;M2-DL2000;1-菌株SD26 基因組;2-16S rRNA 擴增產(chǎn)物圖1 菌株SD26基因組與16S rRNA擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of SD26 genome and 16S rRNA amplification product of strain

圖2 基于16S rRNA 序列的菌株SD26系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain SD26 based on 16S rRNA sequence

2.3 乳酸菌 SD26 的生長動力曲線

由圖3可知,培養(yǎng)4 h時,SD26開始進入對數(shù)生長期,此時其發(fā)酵上清液的pH值在5.0左右,已對白色念珠菌有較高的抑制活性,其抑菌圈直徑為19.25 mm。隨著培養(yǎng)時間的增加,SD26發(fā)酵上清液的pH值不斷降低,而對白色念珠菌的抑菌圈直徑不斷增大。當培養(yǎng)到20 h時,SD26進入穩(wěn)定期后期,發(fā)酵上清液的pH值趨于穩(wěn)定且最小為3.81,此時對白色念珠菌的抑菌圈直徑達到最大,為26.63 mm。

圖3 乳酸菌SD26的生長曲線及不同培養(yǎng)時間下pH和抑菌圈直徑Fig.3 Growth curve of lactic acid bacteria SD26 and the pH value and the diameter of bacteriostatic zone at different culture time注:字母不同表示兩組之間有顯著差異 (P<0.05)

2.4 乳酸菌SD26不同pH值的上清液對白色念珠菌生長的影響

由圖4可知，SD26不同pH值的發(fā)酵上清液對白色念珠菌的生長有不同的影響,其中將白色念珠菌的生長曲線作為空白對照。當SD26發(fā)酵上清液的pH值為3.81時,白色念珠菌24 h都處于較低的OD600且?guī)缀鹾愣ㄔ诹闼健６擲D26發(fā)酵上清液的pH值為6.0時,白色念珠菌的生長曲線趨勢幾乎與空白對照組相吻合。由此可推測SD26上清液的低酸性環(huán)境對白色念珠菌的生長起抑制作用。

圖4 乳酸菌SD26發(fā)酵上清液對白色念珠菌生長過程的影響Fig.4 Effect of lactic acid bacteria SD26 fermentation supernatant on the growth of C.albicans

2.5 乳酸菌SD26抑菌物質(zhì)的確定

由表4可知,隨著SD26發(fā)酵上清液pH值的升高,對白色念珠菌的抑菌圈在變小;當pH值大于5.0時,對白色念珠菌無抑菌作用。而SD26發(fā)酵上清液的不同pH值對白色念珠菌的抑菌圈直徑存在顯著性差異(P<0.05),由此可推測,對白色念珠菌的抑制作用依賴于SD26發(fā)酵上清液的pH值,且低酸性環(huán)境對白色念珠菌有強抑制作用。

表4 乳酸菌SD26不同pH值的發(fā)酵上清液對白色念珠菌的抑制活性Table 4 Inhibitory activity of lactic acid bacteria SD26 fermentation supernatant under different pH values on C.albicans

由圖5可知,在與SD26發(fā)酵上清液pH值相同時,乙酸、D-乳酸均對白色念珠菌有明顯的抑制作用,而L-乳酸對白色念珠菌無抑制作用。且D-乳酸的抑菌圈直徑為20.01 mm,與SD26發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑26.63 mm有著顯著差異(P<0.05),而乙酸的抑菌圈直徑為27.01 mm,與SD26發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。用75%硫酸銨鹽析后酸性上清液有明顯抑菌圈,而中性沉淀復(fù)溶液無抑菌圈,表明SD26發(fā)酵上清液中對白色念珠菌起抑菌作用的物質(zhì)非蛋白質(zhì)類化合物,而是該乳酸菌代謝分泌的有機酸。

圖5 乳酸菌 SD26發(fā)酵上清液(或培養(yǎng)基)的不同處理對白色念珠菌的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of lactic acid bacteria SD26 fermentation supernatant (or medium)on C.albicans注:*表示兩組之間沒有顯著差異 (P>0.05);**表示兩組之間有顯著差異 (P<0.05)

2.6 食源性常見致病菌的抑菌譜

由表5可知,SD26對食源性常見致病菌革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有不同程度的抑制作用。其中,對革蘭氏陽性菌單核細胞增生李斯特氏菌(CMCC54002)的抑菌作用最強,抑菌圈直徑超過20 mm。由此可知,SD26對食源性常見致病菌的抑菌作用較好,有良好的應(yīng)用潛力。

表5 乳酸菌SD26對食源性致病菌的抑菌譜Table 5 Antimicrobial spectrum of lactic acid bacteria SD26 against foodborne pathogens

3 討論

乳酸桿菌菌種具有多樣性,對不同口腔致病菌的作用存在差異[23]。MARSH[24]研究報道,健康人群口腔中乳酸桿菌的檢出率,尤其是植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌的檢出率顯著高于有口腔疾病的患者。將乳酸桿菌同口腔致病菌共培養(yǎng)后,因所處環(huán)境pH值的降低,口腔致病菌被顯著抑制,得出益生菌可以通過產(chǎn)生有機酸來降低環(huán)境pH值,從而實現(xiàn)抑菌的作用[25]。這一結(jié)論與本研究的植物乳桿菌SD26發(fā)酵上清液在低pH時能抑制白色念珠菌生長在幾乎恒定的零水平相吻合。

乳酸菌能夠產(chǎn)生具有抑菌活性的有機酸等代謝產(chǎn)物,抑菌機理通常認為是在酸性pH條件下,以未解離的形式作用于目標細胞膜,破壞細胞膜電化學質(zhì)子梯度從而導(dǎo)致細胞死亡[26]。有關(guān)研究表明[27],酸的抗菌活性與pH的降低以及它們的離解能力有關(guān),這取決于相應(yīng)酸的pKa值和周圍環(huán)境的pH。酸以未離解的形式可溶于脂質(zhì),并且它們通過被動和載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運機制都容易進入微生物細胞。一旦進入細胞,酸就會在堿性環(huán)境中釋放質(zhì)子H+,導(dǎo)致細胞內(nèi)H減少。這會影響微生物的代謝,抑制重要的微生物酶的作用,并迫使細菌細胞利用能量輸出過量的質(zhì)子H+,最終導(dǎo)致細胞能量耗竭而死亡。同時,質(zhì)子H+可以使細菌對酸敏感的蛋白質(zhì)和DNA變性。有機酸的抑菌活性具有pH依賴性,未解離有機酸的抑菌活性高于解離的有機酸。這一結(jié)論與本研究的SD26發(fā)酵上清液對白色念珠菌的抑菌圈直徑受pH顯著影響相吻合。

另外,用75%硫酸銨鹽析SD26發(fā)酵上清液后,鹽析上清液pH為4.01,且有明顯的抑菌圈,而將鹽析上清液pH調(diào)為6.0及以上時,抑菌圈消失,且中性沉淀復(fù)溶液無抑菌圈,表明抑菌活性成分非蛋白質(zhì)類化合物,而是該乳酸菌代謝分泌的有機酸。同時,DONG等[28]研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌可產(chǎn)生抗真菌的代謝產(chǎn)物有機酸,例如乙酸、丙酸和乳酸等。這一結(jié)論與本研究對白色念珠菌起抑菌作用的主要成分為SD26生長代謝分泌的有機酸相吻合。綜上所述,從泡菜中篩選出的菌株SD26經(jīng)鑒定為植物乳桿菌,該乳酸菌對口腔致病菌白色念珠菌的抑菌物質(zhì)為其代謝分泌的有機酸。后期將對菌株SD26二代進行全基因組測序,明確其是否為新菌株,并探究其對白色念珠菌的抑菌物質(zhì)和機理,為將益生菌應(yīng)用到口腔領(lǐng)域提供基礎(chǔ)。