房旭 黃郁晶 阮強 劉維賢

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinomas，OSCC)是頭頸部發(fā)病率最高的惡性腫瘤，老年人群發(fā)病率較高，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，嚴重影響晚年生存質(zhì)量。盡管OSCC的臨床診斷及治療不斷進步，病人術后5年的存活率仍低于50%[1]。

核仁小RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)是一類真核細胞核仁中60～300個核苷酸長度的非編碼RNA，主要參與核糖體RNA(rRNA)轉(zhuǎn)錄后的成熟加工過程。近年來研究表明,snoRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類長度約22個核苷酸的小分子非編碼RNA, 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的表達水平[3]。通過調(diào)節(jié)靶基因的表達, 在細胞的分化、增殖、遷移等過程中具有重要作用[4]。開展snoRNA和miRNA與OSCC關系的研究有可能為OSCC的診斷和治療提供新線索[5]。本研究通過篩選老年OSCC病人的snoRNA及miRNA，選定與OSCC各臨床指征相關、可作為對其診斷或預后具有參考價值的腫瘤生物標志。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 選取2016年1～8月盛京醫(yī)院口腔外科手術治療OSCC病人9例，以及病理科保存石蠟包埋OSCC組織標本35例，合計44例。病人年齡均≥60歲，均經(jīng)病理學診斷為OSCC。病人不合并其他疾病，無器質(zhì)性疾病和既往惡性腫瘤史。新鮮及石蠟鱗癌樣本TNM分期Ⅰ～Ⅳ期分別為21、9、4、10例。根據(jù)腫瘤病理分級低、中、高分別為3例、8例、33例。另外選取正?？谇唤M織作為對照，包括2016年1～8月13例手術治療病人術中切取口腔正常黏膜或舌組織0.5 cm3，以及病理科保存石蠟包埋正?？谇唤M織標本10例，合計23例。

本研究經(jīng)盛京醫(yī)院倫理委員會批準，得到所有病人允許并簽屬知情同意書。

1.2 RNA提取 (1)新鮮組織總RNA的提?。河媒?jīng)焦碳酸二乙酸處理過的剪刀將新鮮組織標本剪碎，采用AxyPrep公司的組織細胞總RNA提取試劑盒提取新鮮組織標本總RNA。 (2)石蠟包埋切片組織標本總RNA的提?。翰捎肁pplied biosystem公司的石蠟包埋組織總核酸提取試劑盒提取石蠟包埋切片組織標本總RNA。提取操作步驟如下：二甲苯溶解石蠟包埋組織切片，50 ℃ 20 min，脫蠟；100%乙醇洗脫二甲苯2遍，室溫揮發(fā)60 min；蛋白酶消化組織塊30 min；洗液清除殘余蛋白酶等，提取總核酸；采用DNA酶消化DNA成分，室溫30 min；過濾柱洗脫3遍，加水溶解，離心，保留洗脫液電泳備用。

1.3 RNA芯片檢測 采用芯片技術對RNA標本進行非編碼miRNA芯片檢測，所用芯片可以檢查。使用生物素標記的miRNA進行芯片雜交：每張Affymetrix芯片加入提取的RNA樣本10μL；將雜交液置于恒溫金屬浴上，99 ℃溫育5 min，然后45 ℃溫育5 min；從恒溫金屬浴上取出雜交混合液，微型離心機13 200 r/min離心5 min，除去雜交液中的不溶性物質(zhì)；注入相應的雜交液；將芯片平衡放置于雜交爐中，48 ℃，60 r/min旋轉(zhuǎn)雜交16 h。清洗、染色及掃描芯片，使用AGCC軟件(Affymetrix GeneChip Command Console Software)將芯片的熒光掃描圖像保存成.DAT文件進行分析。

1.4 TaqMan熒光定量PCR檢測

1.4.1 探針的設計與合成：使用內(nèi)參U6進行miRNA-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及miR-429)及U78的反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR TaqMan探針均由Applied biosystem公司設計并合成。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應：每個樣本均做3個復孔。配制反應體系如下：含有脫氧胸苷三磷酸(dTTP)的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 0.15μL，逆轉(zhuǎn)錄酶50 U，雙蒸水8.16μL，RNase抑制劑0.19μL，RNA樣本1μL。反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 保存。

1.4.3 TaqMan熒光定量PCR：TaqMan? 2×通用PCR Master Mix 10.00μL，雙蒸水7.67μL，Custom TaqMan? Small RNA Assay (20×)1.00μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.33μL。反應條件：95 ℃ 10 min，60 ℃ 60 s,40個循環(huán)。

1.4.4 結(jié)果分析：單個標本檢測值由該標本復孔實驗值均數(shù)得出。相對表達量由ΔCT值計算得出(ΔCT=CT被檢測基因-CTU6)；OSCC組織與正?？谇唤M織的表達量相對倍數(shù)由2-ΔΔCT法計算得出(ΔΔCT=ΔCT口腔鱗癌-△CT正常組織)。

1.5 生物信息學預測 通過miRNA靶基因預測軟件TargetScan(http://www.targetscan.org)、PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de)和 mirnaviewer (http://cbio.mskcc.org)預測miRNA-200家族的靶基因。

1.6 統(tǒng)計學分析 熒光定量PCR結(jié)果均由≥3次試驗結(jié)果統(tǒng)計得出，具有可重復性。采用SPSS 13.0軟件進行相關統(tǒng)計學分析。應用獨立樣本t檢驗分析樣本組間差異；采用多元線性回歸方法分析檢測值與OSCC各臨床指征的相關性；采用ROC曲線分析U78值對OSCC的識別和診斷能力。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 非編碼miRNA芯片檢測結(jié)果 非編碼miRNA芯片共對人基因組544個snoRNA與624個miRNA的表達水平進行了檢測，結(jié)果見圖1。經(jīng)雜交信號比較及統(tǒng)計學分析，與正?？谇唤M織相比，OSCC組織標本中共有65個snoRNA及63個miRNA表現(xiàn)為表達水平上調(diào)；僅有2個miRNA表現(xiàn)為表達水平下調(diào)。依據(jù)篩選條件(在組織中具有較高的表達水平；統(tǒng)計學分析具有顯著差異性)，分別選取snoRNA U78與miRNA-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及miR-429)進行進一步鑒定及相關研究。

圖1 芯片檢測結(jié)果散點圖

2.2 snoRNA U78在OSCC組織中的表達水平 采用TaqMan熒光定量PCR方法對snoRNA U78在OSCC及口腔正常組織中的表達水平進行檢測。由于組織標本分別來源于新鮮組織和石蠟包埋組織，因此，首先對不同標本來源的U78檢測值進行了統(tǒng)計學分析，以排除因標本保存方式不同造成的實驗結(jié)果偏差。經(jīng)分析，不同保存方式的相同組織間檢測值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結(jié)果見圖2。因此，不同保存方式的相同組織的檢測值可以合并分析。通過2-ΔΔCT法計算得出U78表達量的(OSCC組織/正?？谇唤M織)相對倍數(shù)，即22.061=4.17倍，且差異具有統(tǒng)計學意義(見圖3，P=0.019)。

圖2 U78在新鮮組織和石蠟包埋組織中的表達

圖3 U78在OSCC組織及正常組織中的表達

接下來將OSCC組織中U78的表達量與OSCC各項臨床指征(包括臨床分期、病理分級及有無轉(zhuǎn)移)進行多元線性回歸分析。多元線性回歸分析結(jié)果表明，U78的表達量與腫瘤組織病理分級具有顯著相關性(P=0.023);與臨床分期及有無臨床轉(zhuǎn)移等臨床指征無相關性(P=0.159；P=0.711)。ROC曲線分析結(jié)果顯示：AUC為0.996，同時具有較高的敏感性和特異性(敏感度=100%； 特異度=90.2%)，提示U78表達量具備對OSCC的識別和診斷能力?？勺鳛镺SCC生物學診斷的一個輔助檢測指標，參與OSCC的臨床診斷。

2.3 OSCC組織中miRNA-200家族的表達水平 芯片檢測結(jié)果中， miRNA-200家族中有4個成員(miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141)均有較高水平表達。采用TaqMan熒光定量PCR方法分別對miRNA-200家族共5個miRNA在OSCC組織及口腔正常組織中的表達水平進行檢測。ΔCT計算結(jié)果表明，OSCC組織中miR-200a、miR-200b、miR-200c和miR-141的表達量與芯片結(jié)果一致，均高于正?？谇唤M織。芯片結(jié)果未提示miR-429表達異常，但是經(jīng)過熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)miR-429在OSCC組織中也具有較高的表達水平。見圖4。

注：***P<0.001圖4 miRNA-200家族在口腔鱗癌組織中的表達水平

2.4 miRNA-200家族靶基因預測分析 采用miRNA靶基因預測軟件對micRNA-200家族(miR-200s)的靶基因進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個與細胞增殖及腫瘤遷徙轉(zhuǎn)移相關的候選靶蛋白。見圖5。

圖5 miRNA-200家族生物學功能預測

3 討論

老年人是OSCC的高發(fā)人群?？谇粣盒阅[瘤因發(fā)病機制尚不明確，給預防帶來極大困難。煙齡較長的老年人好發(fā)，此外，隨著老年人缺牙增多，佩戴可摘或全口義齒，造成口腔局部不良刺激也是致病因素之一。由于OSCC細胞有轉(zhuǎn)變?yōu)榻櫺园┑奈ｋU且常發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移，手術采用將腫瘤所在部位的舌、頰、牙齦、腭等黏膜及組織結(jié)構徹底清除的治療方法，對其深方的肌肉、神經(jīng)等均會造成不同程度的損傷[6]。大多數(shù)的病人會因為年齡因素造成全身基礎疾病較多且復雜，部分由于家人疏忽，也可導致OSCC確診時，病人已處于中晚期。早前的研究發(fā)現(xiàn)snoRNA以多種方式參與腫瘤的發(fā)生[7]。一些snoRNA如:SNORD12、snoRNA U50等具有抑癌活性，而另一些snoRNA如:SNORD33、snoRNA U70C等的表達水平與病人預后明顯負相關[8]。腫瘤組織中的一些snoRNA能夠提高細胞的增殖能力和克隆形成[9]；相反，癌細胞內(nèi)U50水平明顯增強，可以減少前列腺癌的形成[10]。Yoshida等[11]發(fā)現(xiàn)snoRNA21高表達于結(jié)腸癌組織中，而且其表達水平還與病人預后呈負相關。本研究發(fā)現(xiàn)，snoRNA U78在老年OSCC病人癌組織中呈高表達狀態(tài)，可作為生物診斷指標輔助OSCC的臨床診斷。

miRNA主要通過與靶mRNA結(jié)合，或促使mRNA降解，或阻礙其翻譯，從而抑制目的基因的表達。本研究發(fā)現(xiàn)多個miRNA-200家族基因的靶基因與細胞增殖及腫瘤遷徙轉(zhuǎn)移密切相關，例如β-鏈蛋白與轉(zhuǎn)化生長因子β2(TGF-β2)。多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均與β-catenin密切相關，β-catenin在細胞漿聚集并進入細胞核, 與TCF/LEF家族成員形成復合物, 在其他共激活因子的協(xié)同下, 激活下游基因的轉(zhuǎn)錄,如細胞周期蛋白D1 (cyclin D1)基因等。TGF-β2可參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)，重組其細胞骨架，使細胞顯示出侵襲特性的橫向分化過程。EMT在上皮來源腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲過程中均發(fā)揮著重要作用[12]。近年來大量研究證實，在多種腫瘤組織中存在miRNA-200家族表達失調(diào)，并表現(xiàn)出一定的組織特異性[13-14]。

此外， Li等[15]發(fā)現(xiàn)miR-200a和miR-200b在胰腺癌組織和大部分胰腺癌細胞系中高表達。Skok等[16]發(fā)現(xiàn),與正常結(jié)腸黏膜相比，miR-200c在結(jié)腸癌組織中也異常高表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在OSCC組織中，miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429的表達量均高于正?？谇唤M織，且經(jīng)預測可靶向調(diào)控多個與細胞增殖、腫瘤遷徙轉(zhuǎn)移相關的蛋白表達，因此推測miRNA-200家族可能參與OSCC的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)。以上對老年病人OSCC組織的snoRNA與miRNA的表達情況進行的研究，為OSCC的臨床診斷與治療提供了新的信息與資料。