錢晶晶 王寧

(安徽科技學(xué)院，安徽 滁州 233100)

引言

金銀花(Lonicera japonica Thunb.)為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)植物，多年生纏繞木本[1]，作為我國(guó)歷史悠久的中藥材[2]，其主要有效成分為綠原酸和類黃酮等[3]，具有清熱(尤其兒童退燒)、解毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫力[4,5]等功效，巨有極大的市場(chǎng)需求。目前金銀花的主要栽培方式為大田種植，而綠原酸等有效物質(zhì)的提取又需從植物花中提取，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[6]，利用組織培養(yǎng)技術(shù)能夠建立金銀花離體快繁體系，避免時(shí)間、空間、氣候等條件的限制[7]，提高目標(biāo)化合物產(chǎn)率，可以更好地控制金銀花種苗質(zhì)量，為金銀花藥用化學(xué)物質(zhì)的商業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

本研究以金銀花莖段為外植體，建立離體快繁體系，為金銀花種苗生產(chǎn)，以及有益物質(zhì)的簡(jiǎn)單、快速大規(guī)模提取建立基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)源于安徽科技學(xué)院種植園，秋季選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、種質(zhì)優(yōu)良的金銀花嫩枝作為外植體。

1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，相對(duì)濕度保持在70%左右，光照2500lux，光照周期12h·d-1。

1.3 金銀花離體快繁體系的建立

1.3.1 外植體接種

選取金銀花約1cm嫩枝莖段(帶有1個(gè)腋芽)，先用清水沖洗，放在超凈工作臺(tái)中，用75%的乙醇浸泡30s，再用無(wú)菌水沖洗5遍，用0.1%HgCl2加2滴吐溫消毒9min，最后用無(wú)菌水沖洗5遍。接種到培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)35d。

1.3.2 培養(yǎng)基的選擇

選取MS、1/2MS、WPM、B5 4種基本培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基內(nèi)加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調(diào)至6.5，加入1.0mg·L-1的6-BA。每種培養(yǎng)基作為一個(gè)處理，共4個(gè)處理，每組處理共做15個(gè)重復(fù)。將接種后的金銀花放入培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)35d，觀察金銀花組培苗增殖及植株生長(zhǎng)情況并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算出平均增殖量和平均生長(zhǎng)量。

平均不定芽增殖量(n)=不定芽增殖總量(n)/接種數(shù)(n)×100%

平均生長(zhǎng)量(cm)=(生長(zhǎng)總長(zhǎng)度(cm)-接種長(zhǎng)度)/接種數(shù)

1.3.3 培養(yǎng)激素的選擇

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調(diào)至6.5，分別加入0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1的6-BA，然后放入高壓滅菌鍋(美國(guó)，致微，GR60DA)內(nèi)121℃滅菌20min。在超凈工作臺(tái)(中國(guó)，蘇州凈化，SW-CJ-1D/1G)中把金銀花莖段接入培養(yǎng)基內(nèi)，每個(gè)莖節(jié)上都要保留1～2個(gè)腋芽。共5組處理，每組處理做15個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)35d,觀察金銀花出芽數(shù)及不定芽增殖數(shù)量并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率和平均增殖量。

不定芽誘導(dǎo)率(%)=出芽數(shù)(n)/接種數(shù)(n)×100%

平均增殖量(n)=增殖總量(n)/接種數(shù)(n)

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調(diào)至6.0±0.2，分別加入0mg·L-1、0.5mg·L-1、1.0mg·L-1、1.5mg·L-1、2.0mg·L-1的IBA，然后放入高壓滅菌鍋(美國(guó)，致微，GR60DA)內(nèi)121℃滅菌20min。在超凈工作臺(tái)(中國(guó)，蘇州凈化，SW-CJ-1D/1G)中把金銀花莖段接入培養(yǎng)基內(nèi)，每個(gè)莖節(jié)上都要保留1～2個(gè)腋芽。共5組處理，每組處理做15個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)35d，觀察生根數(shù)量，測(cè)量根長(zhǎng)并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算出生根率和平均根長(zhǎng)。

生根率(%)=生根數(shù)(n)/接種數(shù)(n)×100%

平均根長(zhǎng)(cm)=總根長(zhǎng)(cm)/生根總數(shù)(n)

選用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)加入3%的蔗糖和0.55%的瓊脂，pH調(diào)至6.0～6.5，分別加入NAA濃度0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1和6-BA濃度為0.2mg·L-1、0.4mg·L-1、0.6mg·L-1、0.8mg·L-1、1.0mg·L-1的激素配比，如表1所示，然后放入高壓滅菌鍋(美國(guó)，致微，GR60DA)內(nèi)121℃滅菌20min。在超凈工作臺(tái)(中國(guó)，蘇州凈化，SW-CJ-1D/1G)中將金銀花的幼葉，切成1cm×1cm的方形，在葉片背面葉脈處用手術(shù)刀輕劃2個(gè)傷口，背面朝下接種到培養(yǎng)基上。共25組處理，每組處理做4個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)21d后，觀察愈傷生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)數(shù)、愈傷質(zhì)量，計(jì)算出愈傷誘導(dǎo)率和增長(zhǎng)倍數(shù)。

愈傷誘導(dǎo)率=愈傷誘導(dǎo)數(shù)/接種數(shù)×100%

愈傷誘導(dǎo)平均質(zhì)量=愈傷誘導(dǎo)總量/接種數(shù)

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)金銀花幼苗生長(zhǎng)的影響

金銀花腋芽經(jīng)過(guò)7d的培養(yǎng)開(kāi)始生長(zhǎng)，莖節(jié)開(kāi)始膨大逐漸增高，10d左右叢生芽開(kāi)始產(chǎn)生。由圖1可以看出，不同類型的培養(yǎng)基誘導(dǎo)幼苗平均增殖量從多至少依次為B5、MS、1/2MS、WPM,誘導(dǎo)幼苗平均伸長(zhǎng)量從高至矮依次為MS、1/2MS、WPM、B5。B5培養(yǎng)基其大部分長(zhǎng)出來(lái)的幼苗莖比較細(xì)且植株矮小，葉片黃綠色且蜷縮多，因此B5培養(yǎng)基不利于金銀花的生長(zhǎng)。MS培養(yǎng)基中金銀花長(zhǎng)勢(shì)高、葉片大且顏色翠綠。由此可得，金銀花在MS培養(yǎng)基中的長(zhǎng)勢(shì)比在WPM、1/2 MS、B5 3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)好。

表1 不同濃度激素配比情況

圖1 不同類型培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽的平均增殖量和平均生長(zhǎng)量

2.2 不同培養(yǎng)激素對(duì)金銀花幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 誘導(dǎo)不定芽生成激素的篩選

從圖2可以看出，在同一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同濃度的細(xì)胞分裂素(6-BA)，使植株的成長(zhǎng)狀況產(chǎn)生了很大的變化，細(xì)胞分裂素加快了細(xì)胞的分化及調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)率最高的為MS加6-BA 0.5mg·L-1，不定芽率達(dá)到93.3%，MS加6-BA 2.0mg·L-1、MS加6-BA 1.5mg·L-1和MS加6-BA 1.0mg·L-1的不定芽誘導(dǎo)率為85%，不加6-BA不定芽的誘導(dǎo)率為0。金銀花平均生芽數(shù)由多到少的培養(yǎng)基依次為MS加6-BA 2.0mg·L-1、MS加6-BA 1.5mg·L-1、MS加6-BA 0.5mg·L-1、MS加6-BA 1.0mg·L-1。6-BA在一定濃度范圍，不定芽的數(shù)量隨著激素濃度的升高而增加，當(dāng)6-BA濃度為0.5～1.0mg·L-1時(shí)不定芽的誘導(dǎo)量增加，6-BA濃度在1.0～2.0mg·L-1時(shí)不定芽的誘導(dǎo)量逐漸減少。因此，誘導(dǎo)不定芽增殖的最佳6-BA濃度為1.0mg·L-1。

圖2 不同濃度激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)率和平均增殖量的影響

2.2.2 生根激素的篩選

圖3 不同濃度激素對(duì)生根率和平均根長(zhǎng)的影響

從圖3可以得出,不同濃度的IBA誘導(dǎo)金銀花生根的狀況不同。試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)金銀花平均生根率最高的培養(yǎng)基為MS加IBA 1.5mg·L-1，生根率達(dá)到80%，其次為MS加 IBA 2.0mg·L-1，生根率為53.3%。金銀花平均根長(zhǎng)從長(zhǎng)至短培養(yǎng)基依次為MS加IBA 2.0mg·L-1、MS加IBA 1.5mg·L-1、MS加IBA 1.0mg·L-1、MS加IBA 0.5mg·L-1。雖然MS加IBA 2.0mg·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的金銀花根系最長(zhǎng)，但根系不夠粗壯。生產(chǎn)中所需要的組培苗根系比較健壯、根系較多，這樣更有利于植株的成活。綜合試驗(yàn)結(jié)果得出，篩選出MS加IBA 1.5mg·L-1的培養(yǎng)基更有利于植株生根，并且根系健壯發(fā)達(dá)，種苗成活率能夠大大提高。

3 結(jié)論與討論

組培過(guò)程中，由于植物基因型及生長(zhǎng)特性不同，對(duì)于各種條件的需求存在著很大差異，培養(yǎng)基類型、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、營(yíng)養(yǎng)成分等都對(duì)植物生長(zhǎng)有一定的影響[8]，進(jìn)行針對(duì)性分析研究是非常必要的。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)金銀花組織培養(yǎng)，初步建立了金銀花離體快繁及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的基本體系。

金銀花離體快繁體系的建立，最適金銀花生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基為MS；不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS加6-BA 1.0mg·L-1；根系生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基為MS加IBA 1.5mg·L-1。與傳統(tǒng)繁殖方式相比，金銀花離體快繁體系的建立，提高了金銀花的繁殖系數(shù)，縮短了培育時(shí)間,為其種質(zhì)資源保存、基因工程育種及推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也可促進(jìn)我國(guó)優(yōu)質(zhì)金銀花的培育，為金銀花的工廠化快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗奠定了基礎(chǔ)。