楊冬靜,謝逸萍,張成玲,馬居奎,唐 偉,陳晶偉,孫厚俊

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131)

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展,農(nóng)作物秸稈數(shù)量逐漸增多,但農(nóng)作物秸稈作為生活燃料的用量隨農(nóng)村生活水平的提高而逐漸減少,且長期以來對農(nóng)作物秸稈沒有形成專業(yè)化、產(chǎn)業(yè)化的處理模式而使其被充分利用,大量秸稈在田間地頭被就地焚燒,由此造成資源浪費和環(huán)境的重度污染,嚴(yán)重威脅著農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。秸稈還田既可充分利用秸稈資源,又可減輕焚燒秸稈對生態(tài)環(huán)境的負(fù)面影響,是發(fā)展有機可持續(xù)農(nóng)業(yè)的有效途徑[1,2]。已有的研究表明,還田后的秸稈腐解對于促進(jìn)作物生長、改善和提高土壤質(zhì)量具有重要作用[3]。曹志平等的研究表明還田秸稈的腐解液可以對病原菌產(chǎn)生化感作用，從而減輕下茬作物病害的發(fā)生[4,5]；但李洪林等研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田可以促進(jìn)病原菌的積累,增強連作障礙[6,7]。此外,Yu等研究發(fā)現(xiàn),秸稈還田提高了土壤微生物的數(shù)量和活性[8],而土壤微生物數(shù)量及活性的提高又加速了秸稈的腐解[9],表明秸稈還田與土壤微生物之間是相互促進(jìn)相互影響的。

采用傳統(tǒng)的微生物分離方法分離出的土壤微生物種類只占土壤微生物種類總數(shù)的0.1%～1.0%[10]。采用高通量測序技術(shù)方法能夠更加全面地反映土壤微生物的組成情況,故該方法在微生物群落多樣性研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。本文以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院稻麥輪作模式下紋枯病發(fā)生消長規(guī)律試驗為依托,采用高通量測序的方法,對旋耕條件下不同秸稈還田方式的麥田土壤微生物多樣性進(jìn)行了研究,旨在為通過優(yōu)化秸稈還田方式來調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)系統(tǒng)和提高作物產(chǎn)量等提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和處理

土壤樣品于2019年5月13日采自江蘇省泗洪縣石集鎮(zhèn)稻米文化館秸稈還田試驗地,統(tǒng)一采用旋耕方式，設(shè)置4種秸稈還田方式處理：處理A，稻麥秸稈均不還田(命名為Sample1);處理B，稻麥秸稈全量還田(命名為Sample2);處理C，水稻秸稈全量還田(命名為Sample3);處理D，小麥秸稈全量還田(命名為Sample4)。采用5點取樣法,采集土層深度0～5.0 cm的表層土壤,晃動震落小麥根部松散的土壤后,使用無菌刷子從根部收集殘留土壤,將同一樣方5點取樣的土壤樣本等量混勻作為1個樣品；每種還田方式處理設(shè)置3個重復(fù),共12份土壤樣品,分別編號為Sample1-R1、Sample1-R2、Sample1-R3、Sample2-R1、Sample2-R2、Sample2-R3、Sample3-R1、Sample3-R2、Sample3-R3、Sample4-R1、Sample4-R2和Sample4-R3。將采集好的土壤樣品置于冰上運輸至實驗室,經(jīng)液氮速凍后,置于-80 ℃冰箱保存或采用干冰寄送至鎮(zhèn)江蔚綠生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2 土壤微生物的測序

利用CTAB法抽提土壤基因組的DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。將純化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測；使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(為AXYGEN公司的產(chǎn)品)切膠回收PCR產(chǎn)物,用Tris_HCl洗脫后采用2%瓊脂糖電泳檢測回收的PCR產(chǎn)物。采用Truseq DNA kit (為美國Illumina公司的產(chǎn)品)進(jìn)行文庫構(gòu)建,用Illumina PE250測序平臺檢測16S區(qū),擴(kuò)增引物序列515F為5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。真菌ITS擴(kuò)增引物序列ITS1F為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′；ITS2R為5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.3 生物信息分析流程

對經(jīng)Illumina PE測序得到的PE reads,首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接,同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾；在區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU (Operational Taxonomic Unit)聚類分析和物種分類學(xué)分析；基于OTU聚類分析結(jié)果,可以對OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)的分析以及對測序深度進(jìn)行檢測?；诜诸悓W(xué)信息,可以在各個分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。利用基因序列分類單元OTU指數(shù)和Chao指數(shù)表征群落中物種的數(shù)量,利用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)綜合評估群落中物種的豐富度和均勻度，采用主成分分析方法分析樣本間OTU的相似性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品細(xì)菌測序結(jié)果及測序深度評估

對12個土壤樣品細(xì)菌的16S片段進(jìn)行測序,經(jīng)過優(yōu)化過濾低質(zhì)量序列,共得到586423條優(yōu)質(zhì)序列,平均長度為376.48 bp(表1)。

表1 測序數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析結(jié)果

2.2 土壤樣品中細(xì)菌群落豐度與α多樣性分析

隨著序列數(shù)的增大,4個處理的細(xì)菌稀釋曲線均基本趨于平緩,說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理,更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種(OTUs)。

供試土壤樣品序列經(jīng)拆分、去冗余后，對獲得的高質(zhì)量序列在97%的相似度下進(jìn)行歸類和OTU劃分,4個還田方式處理一共獲得了4699個OTUs,平均分別獲得了2952、2831、3109、2772個OTUs；與處理A相比,處理C的平均OTU數(shù)明顯增加,表明水稻秸稈還田提高了土壤細(xì)菌的多樣性；但是對各組處理數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)群落的均勻度不夠。采用體現(xiàn)群落豐富度的Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)以及表征群落覆蓋度的Coverage指數(shù)進(jìn)行群落的α多樣性分析，結(jié)果見表2。從表2可以看出,處理B和處理C各重復(fù)的Shannon指數(shù)均高于處理A,表明與稻麥秸稈均不還田相比,稻麥秸稈全量還田和水稻秸稈全量還田均對土壤中細(xì)菌多樣性的促進(jìn)作用較強,但各處理間數(shù)據(jù)無顯著性差異;與處理A相比,處理D的Shannon指數(shù)未見明顯升高,說明小麥秸稈還田對土壤中細(xì)菌多樣性的促進(jìn)作用不明顯。

表2 土壤細(xì)菌測序及α多樣性分析結(jié)果

2.3 土壤樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組分分析

在不同秸稈還田方式下根圍土壤細(xì)菌門水平的優(yōu)勢菌群包括變形桿菌門Proteobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、放線菌門Actinobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、浮霉菌門Planctomycetes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、疣微菌門Verrucomicrobia等9個門(圖1A)。在所有樣品中,變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高；在4種還田方式下變形菌門的豐度平均值分別為32.6%、33.6%、33.5%和34.2%；與稻麥秸稈均不還田的對照相比,在其他幾種秸稈還田方式下變形菌門的豐度均有所提高,但在處理間無顯著性差異;門水平的其他幾種優(yōu)勢菌群也有所變化,但是在處理間均無顯著性差異。

在不同秸稈還田方式下根圍土壤細(xì)菌屬水平的群落優(yōu)勢菌群包括厭氧繩菌屬Anaerolineaceae_uncultured、Subgroup6_norank、SC-I-84_norank、芽單胞菌屬Gemmatimonas、KD4-96_norank、Gemmatimonadaceae_uncultured、Gaiellales_norank、Nitrosomonadaceae_uncultured、Arenimonas、Mucilaginibacter、類諾卡氏屬Nocardioides、羅思河小桿菌屬Rhodanobacter、鏈霉菌屬Streptomyces、Blastocatellaceae (Subgroup4)_uncultured、藤黃單胞菌屬Luteimonas、浮霉菌屬Planctomycetaceae_uncultured、馬賽菌屬Massilia、Tepidisphaeraceae_norank、Anaerolinea、Subgroup7_norank、Humibacillus、Marmoricola、Comamonadaceae_uncultured、C0119_norank、Bryobacter、Xanthomonadales Incertae Sedis_uncultured等26個屬(圖1B),其中,7個屬因在分類學(xué)數(shù)據(jù)庫分類學(xué)譜系的中間等級,沒有科學(xué)名稱,所以用norank作為標(biāo)記。在26個優(yōu)勢屬中,4個處理下厭氧繩菌屬Anaerolineaceae_uncultured的豐度最高,分別為8.3%、7.7%、7.4%和7.9%；與不還田對照相比,3種不同秸稈還田方式下厭氧繩菌屬的豐度有所降低,但無顯著性差異。優(yōu)勢屬分析結(jié)果表明,在不同秸稈還田方式下其他優(yōu)勢細(xì)菌屬水平在一定程度上發(fā)生了變化。

圖1 4種秸稈還田方式下根圍土壤細(xì)菌門水平和屬水平的群落豐度

2.4 4種還田方式下根圍土壤細(xì)菌群落的β多樣性分析

對4種秸稈還田方式下麥田土壤中細(xì)菌OTU的組成進(jìn)行主成分分析,從圖2可以看出,稻麥秸稈均不還田的空白對照與稻麥秸稈全量還田、水稻秸稈全量還田以及小麥秸稈全量還田處理之間的距離較遠(yuǎn),說明在不還田和還田處理間土壤細(xì)菌OTU組成的差異較大,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也差異較大。而在3個秸稈還田方式處理之間的距離較近,說明在秸稈還田下土壤細(xì)菌OTU組成的差異較小,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也相近。

圖2 在4種秸稈還田方式下麥田土壤中細(xì)菌OTU組成的主成分分析結(jié)果

2.5 4種秸稈還田方式下根圍土壤細(xì)菌群落組成及差異物種

差異物種分析結(jié)果(圖3和表3)表明：稻麥秸稈均不還田對照組Sample1的差異物種為放線菌目Gaiellales、藍(lán)細(xì)菌Cyanobacteria、鉻還原間孢囊菌屬Intrasporangium等14個物種,其中放線菌目Gaiellales的豐度最高，為4.41%；在稻麥秸稈全量還田處理下差異物種為Longimicrobia綱、Longimicrobiales目、Londimicrobiaceae科等20個物種,其中Longimicrobia綱的豐度最高，為3.76%;在水稻秸稈全量還田處理下差異物種為Rhodospirillales紅螺菌目、Rhodosppirillaceae紅螺菌科、Inquilinus屬等15個物種,其中Rhodospirillales的豐度最高，為4.37%;在小麥秸稈全量還田處理下差異物種有Mucilaginibacter、Cstemulisporaceae、Bacteroidetes_vadinHA17等18個物種,其中Mucilaginibacter屬的豐度最高，為4.21%;在4種不同秸稈還田方式下細(xì)菌群落的差異物種豐度為1.51%～4.84%。

圖3 在4種還田方式下根圍土壤優(yōu)勢細(xì)菌及其豐度

表3 在4種還田方式下根圍土壤中顯著性差異細(xì)菌的LDA分值

續(xù)表3：

2.6 土壤樣品真菌測序結(jié)果及測序深度評估

對12個土壤樣品真菌的ITS片段進(jìn)行測序,經(jīng)過優(yōu)化過濾低質(zhì)量序列,共得到了553719條優(yōu)質(zhì)序列,平均長度為255.66 bp(表4)。

表4 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果

2.7 土壤樣品中真菌群落豐度與α多樣性分析

隨著序列數(shù)的增大,在4種秸稈還田方式下的土壤真菌稀釋曲線均基本趨于平緩,說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理。供試土壤樣品序列經(jīng)拆分、去冗余后對獲得的高質(zhì)量序列在97%的相似度下進(jìn)行歸類和OTU劃分,4個還田方式處理一共獲得了1674個OTUs,處理A、B、C、D平均分別獲得了572、558、498、699個OTUs(表5)。與處理A相比,處理D的OTU數(shù)量提高了,相應(yīng)地其Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)也提高了,表明麥秸還田提高了土壤真菌的多樣性。其他兩種還田方式處理也在一定程度上改變了土壤真菌的多樣性。

表5 土壤樣品真菌測序及α多樣性分析結(jié)果

2.8 土壤樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)組分分析

在不同秸稈還田方式下根圍土壤真菌門水平的主要類群為Fungi_norank、子囊菌門Ascomycota、擔(dān)子菌門Basidiomycota、Unclassified、毛霉門Mucoromycota,其中有大量未知真菌的豐度值在43.5%～48.7%;其次是子囊菌門真菌,其豐度值為31.4%～34.6%。

在不同秸稈還田方式下根圍土壤真菌屬水平的主要類群為Fungi_norank、Bolbitiaceae_norank、葡萄孢屬Botrytis、Unclassified、鏈格孢屬Alternaria、Apodus、Paraglomerales_norank、青霉屬Penicillium、 黃絲曲霉屬Talaromyces、帚枝霉屬Sarocladium、子囊菌屬Ascomycota_norank、線黑粉酵母屬Filobasidium、小羊蹄菌屬Microdochium、附球菌屬Epicoccum、鐮刀菌屬Fusarium、Tomentellopsis、Hypholoma屬、擲孢酵母屬Sporobolomyces、芽枝霉屬Cladosporium、Basidiomycota_norank、Lasiosphaeriaceae_norank、曲霉屬Aspergillus、絲枝霉屬Aphanocladium、球腔菌屬Phaeosphaeria、木霉屬Trichoderma、黑孢屬Nigrospora、Simplicillium、旋孢腔菌屬Cochliobolus等28個屬(圖4)。

圖4 在4種秸稈還田方式下土壤根圍真菌門水平和屬水平的群落豐度

2.9 在4種秸稈還田方式下根圍土壤真菌群落的β多樣性分析

對4種秸稈還田方式下麥田土壤中真菌OTU的組成進(jìn)行主成分分析,從圖5可以看出,處理A與處理B、處理C間的距離較近,說明土壤真菌OTU組成相近,真菌群落結(jié)構(gòu)也相近;而處理D與其他3個處理間的距離較遠(yuǎn),說明土壤真菌OTU組成差異較大,真菌群落結(jié)構(gòu)差異也較大。

圖5 在4種秸稈還田模式下麥田土壤中真菌OTU主成分分析結(jié)果

2.10 在4種秸稈還田方式下根圍土壤真菌群落組成及差異物種

從圖6可以看出,在稻麥秸稈均不還田的對照土壤中真菌有枝孢屬Cladosporium、煤炱菌科Cladosporiaceae、小毛菌屬Hirsutella等14個差異物種,其中枝孢屬的豐度最高,為4.12%;在稻麥秸稈全量還田的土壤中真菌有田頭菇屬Agrocybe、蠟蚧菌屬Lecanicilliun、葡萄座腔菌科Botryosphaeriales等6個差異物種,其中田頭菇屬的豐度最高,為3.5%;在水稻秸稈全量還田的土壤中真菌有糞殼菌綱Sordariomycetes、糞殼菌目Sordariales和毛球殼科Lasiosphaeriaceae等15個差異物種,其中糞殼菌綱的豐度值最高,為5.19%；在小麥秸稈全量還田的土壤中真菌有髮菌科Trichocomaceae、黃絲曲霉屬Talaromyces、Striatibotrys屬等3個差異物種,其中髮菌科的豐度值最高，為4.63%(表6)。

表6 在4種秸稈還田方式下根圍土壤中顯著性差異真菌的LDA分值

圖6 在4種秸稈還田方式下根圍土壤優(yōu)勢真菌種類及差異物種

3 小結(jié)與討論

土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)可以在一定程度上反映農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的基本情況。保持土壤微生物群落多樣性及其驅(qū)動下的生態(tài)過程多樣性是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)賴以生存的基礎(chǔ)[11]。在秸稈還田條件下土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究還不夠系統(tǒng)。一般認(rèn)為長期保護(hù)性耕作(免耕、少耕和秸稈還田等)能改善微生物的群落結(jié)構(gòu),提高土壤微生物的多樣性[12,13],但也有部分研究結(jié)果指出短期耕作并未影響微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性[14,16]。

本研究的土壤細(xì)菌多樣性分析結(jié)果表明：在4種還田方式下變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高；與稻麥秸稈均不還田的對照相比,其他幾種秸稈還田方式下變形菌門的豐度均有所提高,門水平的其他幾種優(yōu)勢菌群也有所變化；在4種還田方式下,屬水平的共有26個優(yōu)勢菌群,其中厭氧繩菌屬Anaerolineaceae_uncultured的豐度最高；與不還田對照相比,3種秸稈還田方式下厭氧繩菌屬的豐度有所降低,屬水平的其他優(yōu)勢菌群也在一定程度上發(fā)生了變化,但這些變化均無顯著性差異。主成分分析結(jié)果表明：稻麥秸稈均不還田的對照與3種秸稈還田方式處理間的距離較遠(yuǎn),說明還田可以在一定程度上改變土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)；在不同處理之間存在14～20種顯著差異性細(xì)菌物種。

本文的土壤真菌多樣性分析結(jié)果表明：麥秸還田提高了土壤真菌的多樣性,其他兩種還田方式也在一定程度上改變了土壤真菌的多樣性；在4種還田方式下真菌門水平的優(yōu)勢菌群包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、毛霉門和一些未分類和未知真菌,屬水平的優(yōu)勢菌群共有28種。主成分分析表明：小麥秸稈全量還田對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大,在不同還田方式處理間存在3～14種顯著差異性物種。在本研究中,4種秸稈還田方式從2017年秋季開始實施,至2019年5月小麥?zhǔn)斋@前期采集土樣,歷時近2年,屬于短期不同秸稈還田模式下的土壤微生物多樣性研究,本研究結(jié)果表明不同秸稈還田方式改變了土壤中細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)和差異物種,說明秸稈還田在一定程度上改變了土壤微生物的多樣性、菌群的相對豐度以及差異物種,但是由于秸稈還田時間較短,在各處理間未見顯著性差異,這與Petersen等學(xué)者[14,15]的研究結(jié)果相符。鑒于秸稈還田對土壤微生物多樣性影響的復(fù)雜性,今后還需要進(jìn)一步開展該方面的長期定位試驗。