杜文麗，林 文，鐘開勤，陳繼兵，陳中釤， 高 山

(福州市蔬菜科學研究所，福建 福州 350111)

番茄是一種典型的喜溫性蔬菜作物，因其較高的營養(yǎng)價值且兼具美容保健功效，現已成為露地、塑料大棚、日光溫室及各類保護地設施蔬菜的主栽物種[1]。近幾年，各種病害的流行發(fā)生成為制約番茄生產發(fā)展的最重要原因，病蟲害交叉侵染嚴重，連作障礙使番茄病蟲害發(fā)生程度不斷攀升，而保護地栽培受設施條件的限制導致輪作難以實施，使番茄的生產效益提高有限[2-3]。土傳病害如青枯病、枯萎病和根結線蟲等的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，以番茄青枯病為例，該病廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)，在我國長江以南各地尤其是華南地區(qū)經常大面積暴發(fā)，重病田塊的死株率達80%以上，使番茄減產超過60%[4-6]。近年來，番茄砧木抗病育種多集中于一種病害，蘇銀玲等簡要概述了當前國內外番茄抗病育種、生物防治、農業(yè)防治和化學防治等的研究進展，提出了綜合治理防治番茄葉霉病的理念[7]。莫豪葵等[8]利用3個不同的接穗品種進行嫁接試驗，確定了其高抗青枯病特性以及較強的嫁接親和性與共生性。褚新培等對枯萎病病原菌采用形態(tài)學和分子生物學等方法進行鑒定，鑒定了多個番茄砧木材料的抗枯萎病能力[9]。針對聚合多抗番茄砧木育種的報道鮮見。

實踐證明：通過選擇聚合多抗基因高抗砧木進行嫁接栽培是防止蔬菜土傳病害大面積暴發(fā)、克服設施番茄連作障礙、提高病蟲害防控水平、減少農藥施用、提升茄果類蔬菜產量及品質的重要途徑，因此加快選育優(yōu)良適宜的番茄砧木育種材料迫在眉睫[10-11]。本研究通過廣泛收集番茄種質資源，采用田間抗性鑒定方法在番茄青枯病高發(fā)病區(qū)進行自然篩選，篩選出20個高世代穩(wěn)定的多抗番茄砧木自交系材料，可為選育適用于福建番茄生產的砧木材料提供有利支持。我們利用目前已發(fā)表的抗枯萎病(I-2)、抗青枯病(RRS-342)、抗煙草花葉病TMV(Tm-2a)、抗根結線蟲(Mi-1)和抗葉霉病(Cf-9)的基因標記進行單株抗病性鑒定[9,12-13]，再對抗青枯病為主、兼抗其他土傳病害的番茄砧木材料進行田間鑒定，獲得了聚合多個青枯病抗性較強且穩(wěn)定、兼抗其他多種常見病害的番茄砧木自交系材料，為選育適用于福建番茄砧木一代雜種多抗品種的培育創(chuàng)造了種質材料和理論參考。

1 材料與方法

試驗地設在福州市蔬菜科學研究所科研基地，其部分區(qū)塊由于多年連續(xù)種植茄科類作物，已成為番茄青枯病重災區(qū)，不抗青枯病的番茄品種感病率達80%以上，甚至絕收，這為篩選抗青枯病的番茄砧木材料提供了理想的自然篩選場所。

1.1 番茄砧木材料來源

自2014年起福州市蔬菜科學研究所番茄課題組從國內外征集番茄品種材料100余份進行試種，對青枯病抗性較強且穩(wěn)定、兼抗其他多種常見病害的品種材料進行自交繁育單株留種，到2019年共獲得穩(wěn)定抗病且符合作番茄砧木的育種材料20份，其特征及來源見表1。

表1 供試番茄砧木材料及來源

1.2 DNA提取與5個抗病基因的分子標記檢測

摘取番茄植株嫩葉，參考改良的CTAB法提取基因組DNA[14-15]，檢測 DNA 濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，再用滅菌dd H2O稀釋至10 ng/μL，-20 ℃保存。

抗枯萎病基因分子標記檢測使用的引物由東北農業(yè)大學番茄課題組徐薪惟設計開發(fā)[9]；抗青枯病基因分子標記檢測使用的引物由浙江大學番茄課題組設計開發(fā)[12]；抗煙草花葉病毒、抗根結線蟲、抗葉霉病基因分子標記檢測使用的引物由華中農業(yè)大學番茄課題組孫亞林設計開發(fā)[16](表2)。所有引物訂購自生工生物工程(上海)股份有限公司。采用2×Pro Taq 預混液(大連寶生物工程有限公司)TaKaRa的PCR反應體系(25 μL)：2×Pro Taq Master Mix 12.5 μL、正反向引物(1.0 μmol/L)各 0.5 μL、DNA 模板(300～500 ng/μL)1.0 μL，用Rnase free water 補足至25 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性 30 s；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃最終延伸2 min，保存。PCR 產物在1%瓊脂糖凝膠100～110 V電壓下電泳30 min，在凝膠成像系統(tǒng)上顯示結果。

表2 用于分子標記進行抗病性鑒定的引物序列

1.3 田間抗病性鑒定

于2019年10月，在福州市蔬菜科學研究所試驗基地開展番茄病害抗性鑒定試驗，按常規(guī)方法進行栽培管理。采用五點取樣法調查20份番茄砧木自交系材料大田青枯病、煙草花葉病、南方根結線蟲、葉霉病的發(fā)病情況，計算病情指數，每組設3次重復。由于福建地區(qū)自然環(huán)境的原因，枯萎病不易發(fā)病，故無法統(tǒng)計。

青枯病的發(fā)生程度參照白占兵等[17]制定的分級標準。0級：為無病癥；1級：植株頂端少數枝葉萎蔫；2級：全株1/3的植株自上而下萎蔫，但早晚尚有恢復能力；3級：全株1/2的枝葉萎蔫，且無恢復能力；4級：全株枝葉萎蔫、枯死。青枯?。焊呖?HR)，0≤DI≤20.0；抗病(R)，20.060.0。

TMV的發(fā)生程度參照朱明濤等[14]TMV群體抗性分級標準。0級：植株健康，無癥狀；1級：明脈，輕花葉；3級：心葉及中部葉片花葉；5級：心葉及中部葉片花葉，個別葉片畸形、皺縮，植株輕度矮化；7級：重花葉，大量葉片畸形、皺縮或植株矮化；9級：重花葉，畸形，植株矮化嚴重或死亡。病情指數=0為免疫；0<病情指數<2為高抗(HR)；2<病情指數<15為抗病(R)；15<病情指數<30為耐病(MR)；病情指數>30為感病(S)。

南方根結線蟲的發(fā)生程度參照毛愛軍等[18]的分級標準。0級：植株根部完全健康；1級：植株根部有1至2個根瘤；2級：植株根部有3至10個根瘤；3級：植株根部有11至30個根瘤；4級：植株根部有31至100個根瘤；5級：植株根部根瘤數超過100個。南方根結線蟲抗性分級：免疫(I)，DI=0；高抗(HR)，050.0。

葉霉病的發(fā)生程度參照馮壯志[13]的分級標準。0級：無癥狀；1級：葉片出現褪綠至黃色病斑；3級：葉片病斑上產生少量白色菌絲，無孢子；5級：接種葉病斑上產生菌絲和孢子；7級：接種病斑上產生大量孢子，并且菌絲發(fā)展到上部葉，但無孢子；9級：接種葉病斑上生有大量孢子。病情指數=0為免疫；0<病情指數<5為高抗；5<病情指數<15為抗病(R)；15<病情指數<30為耐病(MR)；病情指數>30為感病(S)。

計算公式：病情指數(DI)=Σ(各級病株數×相應級數)/(調查總株數×最高級數)×100。

2 結果與分析

2.1 番茄砧木材料分子標記抗性鑒定結果

含抗枯萎病I-2基因的番茄砧木材料能擴增出約1188 bp目的片段，如圖1、表3所示，在Y-7-1、ZM48-2-1-3等13份材料中含有I-2基因，而另外7份材料則無。

表3 20份番茄砧木抗性基因檢測結果

含抗青枯病RRS-342基因的番茄砧木能擴增出約342 bp目的片段，如圖1、表3所示，Y-7-1、ZM48-2-1-3等10個材料含有RRS-342基因，而另外10份材料則無。

含有抗煙草花葉病Tm-2a基因的番茄砧木材料能擴增出約472 bp目的片段，而不含Tm-2a基因的材料則無擴增帶，如圖1、表3所示，供檢測的20份番茄砧木材料全部含有Tm-2a基因。

含抗根結線蟲Mi-1基因的番茄砧木材料能擴增出大約556 bp目的片段，如圖1、表3所示，Y-7-1、Y-13-3-2等5個番茄砧木材料可以擴增出大小為556 bp 的條帶，說明這5份番茄砧木材料含有Mi-1基因，另外15份材料則無。

含抗葉霉病Cf-9基因的番茄砧木材料能擴增出大約514 bp的片段，不含Cf-9基因的材料則無擴增帶，如圖1、表3所示，在Y-7-1、ZM16-1-E等13個番茄砧木材料中含有Cf-9基因，另外7份材料則無。

2.2 番茄砧木育種材料田間抗性鑒定結果

大部分番茄砧木材料對南方根結線蟲、葉霉病，尤其是青枯病的田間抗性都達到了高抗或免疫水平，對煙草花葉病毒的抗性也達到抗以上水平(表4)， 這說明經過多年的田間自然環(huán)境選擇是有效的。

表4 20份番茄砧木材料田間抗性鑒定結果

Y-7-1、ZM48-2-1-3、ZM36-3-6-1、ZM61-1-2-1這4種材料的青枯病的病情指數為0，且均檢測到含有抗青枯病基因標記；ZM16-1-E、ZM5-1-1-3、ZM22-1-10、ZM22-1-7-12共4個材料的南方根結線蟲病情指數為0，其中ZM22-1-10和ZM22-1-7-12檢測到含有抗根結線蟲基因標記；Y-7-1、ZM5-1-1-3、ZM36-3-6-1這3種材料的葉霉病情指數為0，Y-7-1和ZM36-3-6-1檢測到含有抗葉霉病基因標記。Y-7-1、ZM22-1-10的青枯病、煙草花葉病毒、根結線蟲、葉霉病病情指數均達到抗以上水平，且均檢測到對應的抗病基因標記，由此表明這2個番茄材料是聚合多抗基因的番茄砧木。

3 討論

華南地區(qū)受高溫高濕氣候條件的影響，番茄病害尤其是青枯病發(fā)生極為普遍，造成嚴重的減產絕收，嚴重制約了番茄產業(yè)的發(fā)展；優(yōu)質品種抗病害種類單一且施用藥劑效果有限[4，18]。較為有效安全的防治方法是選用高抗番茄青枯病的材料作砧木進行嫁接種植，這對提高番茄產量及保障農產品安全生產可以起到很大的作用[19-21]。

本研究對收集的番茄品種材料經6代以上自交獲得穩(wěn)定的20份番茄砧木材料進行了田間鑒定，結合分子標記技術對抗枯萎病、青枯病、煙草花葉病、根結線蟲和葉霉病共5種抗性基因進行檢測。結果表明，參試的20 份番茄砧木材料對枯萎病、青枯病、南方根結線蟲等抗性都達到了抗、高抗或免疫水平，說明經過多年的田間自然環(huán)境選擇是有效的。其中，Y-7-1、ZM48-2-1-3、ZM36-3-6-1、ZM61-1-2-1這4種材料青枯病的病情指數為0，且均檢測到含有抗青枯病基因標記；ZM16-1-E、ZM5-1-1-3、ZM22-1-10、ZM22-1-7-12 這4種材料的南方根結線蟲病情指數為0，且ZM22-1-10和ZM22-1-7-12檢測到含有抗根結線蟲基因標記；Y-7-1、ZM5-1-1-3、ZM36-3-6-1這3種材料的葉霉病情指數為0，Y-7-1和ZM36-3-6-1檢測到含有抗葉霉病基因標記。本研究的大多數田間抗病性鑒定結果與分子鑒定結果相對應，尤其是Y-7-1、ZM22-1-10的青枯病、煙草花葉病、根結線蟲、葉霉病病情指數均達到抗病以上水平，且所有抗病基因均被檢測得到，因此，這2個番茄材料是聚合多抗基因的番茄砧木，說明采用分子標記技術對抗病基因進行檢測結合田間抗病性鑒定篩選出聚合多抗基因的番茄材料的方法是可行并且有效的，可為加速培育優(yōu)質番茄砧木品種提供參考。ZM36-1-4-11能鑒定得到抗青枯病基因，但田間抗性鑒定只達到抗病標準。所有的番茄砧木材料都能鑒定得到抗煙草花葉病基因，但田間抗病性表現不一，猜測是由于作物的抗病性大多屬于多基因控制的數量遺傳性狀，其抗性表達程度易受環(huán)境變化影響[22-25]。下一步應進行抗病番茄砧木組合配制并對番茄嫁接親和性及共生性進行研究，對不同生理小種抗性的水平和持久性進行進一步驗證；在利用分子標記輔助聚合抗病基因過程中，還要綜合考慮如果形、果色、果實質量、品質等其他因素。綜上所述，只利用傳統(tǒng)的育種方法將多個抗性基因聚合在一起是相當困難的，本研究對多個抗性基因進行檢測結合田間鑒定，獲得2個聚合多抗番茄砧木，減少了選擇的盲目性，為番茄砧木育種創(chuàng)造了好材料，縮短育種進程。