郝亞娟，劉穎斌

1.上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院普外科，上海市膽道疾病研究中心，上海200092；2.上海市膽道疾病研究重點實驗室，上海200092；3.上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院膽胰外科，癌基因與相關基因國家重點實驗室，上海市腫瘤研究所，上海200120

RNA 修飾在生命活動和疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。目前，已有150 多種RNA 修飾，涉及信使RNA （messenger RNA，mRNA）、非編碼RNA （noncoding RNA， ncRNA）、 轉運RNA （transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、核內(nèi)小RNA （small nuclear RNA， snRNA） 和核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）。其中，甲基化修飾是一種非常廣泛的修飾，約占RNA總修飾類型的2/3。甲基化修飾發(fā)生在RNA 上的位置主要是堿基的氮原子（N）、嘌呤和嘧啶的碳原子（C）、2′-OH的氧原子（O）上。氮6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，m6A）修飾是其中具有代表性的修飾之一。

1 RNA m6A甲基化修飾

1.1 RNA m6A甲基化修飾的特征

m6A 修飾是真核生物mRNA 中一種高豐度的表觀轉錄組學修飾。m6A 廣泛分布在自然界，包括植物、動物、原核生物和病毒中。m6A 分布在不同的RNA 類型中。在古生菌和細菌中，主要分布于tRNA 和rRNA；在真核生物中，除分布于rRNA 外，還分布于mRNA 和ncRNA 中。不同mRNA 的m6A 水平是不同的。在每1 000 個核苷酸中，約有32個GAC/AAC位點，但其中只有1～2個能被甲基化。一般mRNA 的平均長度為3 kb，測序可檢測到1～5個m6A修飾［1-2］。

化學方法和m6A 免疫共沉淀高通量測序（m6Aspecific methylated RNA immunoprecipitation high throughput sequencing，meRIP-seq）發(fā)現(xiàn)m6A 保守的基序為RRACH（R 通常為G 和A，H 通常為A、C 和U），其中最經(jīng)典的基序為GGACU。在人和小鼠細胞中，目前發(fā)現(xiàn)約有7 000個mRNA 存在m6A 修飾，且具有很高的保守性。meRIP-seq 揭示了這種甲基化修飾主要分布在mRNA的編碼區(qū)、剪切位點附近和靠近終止密碼子的3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′UTR）；此外，m6A 在長的外顯子區(qū)也有分布［1-2］。

1.2 RNA m6A甲基化修飾酶和結合蛋白

RNA m6A 修飾是動態(tài)可逆的，發(fā)揮著重要的分子功能。RNA m6A 修飾由甲基轉移酶復合物Wilms’腫瘤蛋白1 相關蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）/甲基轉移酶樣3 （methyltransferase like 3，METTL3）/甲基轉移酶樣14（methyltransferase like 14，METTL14）以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）為甲基供體催化形成［3-5］，由去甲基化酶α-酮戊二酸依賴的加雙氧酶AlkB 同源蛋白5（AlkB homolog 5，ALKBH5）［6］或FTO （FTO α -ketoglutarate dependent dioxygenase）［7］在Fe2+、α-酮戊二酸輔助下催化去除，能被含有YTH 結構域的m6A 讀碼器，如YTH 結構域m6A RNA 結合蛋白1～3 （YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1-3，YTHDF1-3）、YTH 結構域包含蛋白1～2（YTH domain containing 1-2，YTHDC1-2）識別。定位在細胞質的YTHDF2 能夠調控mRNA 的穩(wěn)定性，YTHDF1 和YTHDF3 能夠調控mRNA 的翻譯效率，YTHDC2 能夠促進翻譯；定位在細胞核的YTHDC1 能夠調控前體mRNA 的可變剪接［8］、出核［9］、X 染色體沉默［10］。此外，微RNA（microRNA，miRNA）能夠通過序列配對機制調控mRNA m6A的水平［11］。

后來的研究相繼發(fā)現(xiàn)了一些m6A 的修飾酶，包括甲基轉移酶的組分vir 樣m6A 甲基轉移酶相關（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA，KIAA1429）、鋅指CCCH 類包含蛋白13（zinc finger CCCH-type containing 13，ZC3H13）、Cbl 原癌基因樣1 （Cbl proto-oncogene like 1，HAKAI）、RNA 結合基序蛋白15/15B （RNA binding motif protein 15/15B，RBM15/15B），它們能催化大部分的RRACH 基序甲基化；另外一個甲基轉移酶——甲基轉移酶樣16（methyltransferase like 16，METTL16）能催化甲硫氨酸腺苷轉移酶 2A （methionine adenosyltransferase 2A，MAT2A）發(fā)卡結構頂部的UAC（m6A）GAGAA甲基化。其中一類結合蛋白，不均一核糖核蛋白C/G （heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C/G，HNRNPC/G）和不均一核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，HNRNPA2B1）能夠識別莖環(huán)結構的m6A 修飾并調控其莖和環(huán)結構的轉換，當其有m6A 修飾并結合時，主要為環(huán)結構，沒有m6A 修飾時為莖結構。另外一類結合蛋白為常見的RNA 結合蛋白，如含有KH 結構域的胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白1～3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1-3，IGF2BP1-3） 和RGG 結構域的FMRP 翻譯調節(jié)子1（FMRP translational regulator 1，F(xiàn)MR1）。除此之外，脯氨酸豐富的卷曲螺旋2A （proline rich coiled-coil 2A，PRRC2A）能夠識別m6A并影響少突膠質細胞發(fā)育和髓鞘形成。

對m6A相關酶的功能研究發(fā)現(xiàn)，這些基因活性異常導致了上千種基因的表達異常，提示了m6A在RNA代謝方面的重要作用。m6A可能影響脂肪代謝、精子發(fā)育、腫瘤生成［12-13］、干細胞定向分化、細胞重編程、生物鐘節(jié)律、細胞分裂、記憶和神經(jīng)發(fā)育以及其他一些生命過程。

2 RNA m6A 甲基化修飾與腫瘤的關系及其抑制劑

2.1 FTO與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關系及其抑制劑

FTO 和ALKBH5 是人類中大腸桿菌DNA 烷基化去甲基化酶AlkB 同源蛋白家族成員，含有保守的結合二價鐵離子的組氨酸-天冬氨酸-組氨酸（histidine-aspartic acidhistidine，HDH）結構域和結合2-酮戊二酸以及識別RNA底物的精氨酸-x-x-精氨酸（arginine-x-x-arginine，RxxR）功能結構域。

FTO 是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A 的去甲基化酶，涉及多種疾病，如肥胖、糖尿病、急性髓細胞性白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）、惡性膠質瘤、黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、阿爾茨海默病等。

2.1.1 FTO在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用

（1） FTO 與AML FTO 高表達于AML 的一些特定亞型中，如t（11q23）/MLL 重排型、t（15；17）/PMLRARA 型、FLT3-ITD 型及NPM1 突變型。FTO 能增加AML原癌基因介導的細胞轉化，促進AML的發(fā)生。FTO通過去除其靶標錨蛋白重復和SOCS 盒包含2（ankyrin repeat and SOCS box containing 2，ASB2）及維甲酸受體α（retinoic acid receptor α，RARA）mRNA上的m6A甲基化修飾，抑制ASB2和RARA的表達，從而抑制全反式維甲酸（all-transretinoic acid，ATRA） 誘導的AML 細胞分化［14］。

（2） FTO 與惡性膠質瘤 RNA m6A 甲基化修飾能促進惡性膠質瘤干細胞的自我更新和腫瘤生成。敲低RNA m6A 甲基轉移酶復合物的關鍵組分METTL3或METTL14，能明顯促進人類惡性膠質瘤干細胞的生長、自我更新和腫瘤生成。反之，過表達METTL3或使用抑制劑抑制RNA m6A 的去甲基化酶FTO，能抑制惡性膠質瘤干細胞的生長和自我更新。而且，抑制FTO 能抑制惡性膠質瘤的進展，延長荷瘤小鼠的存活時間。RNA m6A 甲基化測序發(fā)現(xiàn)METTL3或METTL14敲低后，惡性膠質瘤干細胞中一些具有關鍵生物學功能的基因的mRNA m6A 修飾水平和mRNA 表達水平發(fā)生變化，如ADAM 金屬肽酶結構域19 （ADAM metallopeptidase domain 19，ADAM19）。這些結果提示mRNA m6A 甲基化修飾可能是惡性膠質瘤的一個潛在的治療靶標［15］。

（3） FTO 與黑色素瘤 mRNA m6A 去甲基化酶FTO能促進黑色素瘤的生長，抑制抗程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）的免疫治療效果。FTO 在人黑色素瘤中高表達，能促進小鼠的黑色素瘤生成。代謝饑餓壓力誘導自噬和核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路激活，進而激活FTO。敲低FTO能增加關鍵的促癌的黑色素瘤細胞的基因包括PD-1、C-X-C 基序趨化因子受體4 （C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4） 和SRY 盒轉錄因子10 （SRY-box transcription factor 10，SOX10）的m6A 甲基化水平升高，導致m6A 結合蛋白YTHDF2 引起的RNA 降解增加。在小鼠中，敲低FTO能增加黑色素瘤細胞對γ 干擾素（interferon γ，IFNγ）和抗PD-1 治療的敏感性，激活適應性免疫。這些結果提示，將FTO 的抑制劑和抗PD-1 治療結合起來，或許能抑制黑色素瘤的免疫逃逸［16］。

（4） FTO 與乳腺癌 mRNA m6A 去甲基化酶FTO 在乳腺癌中高表達，并與患者的預后呈負相關。FTO 能在體外和體內(nèi)促進乳腺癌細胞系的增殖、克隆形成和轉移。BCL2 互作蛋白3（BCL2 interacting protein 3，BNIP3）是一個促凋亡基因，是FTO 的下游靶標。FTO 能去除BNIP3mRNA 3′UTR 的m6A 甲基化修飾，促進BNIP3的降解，但其降解不依賴于m6A結合蛋白YTHDF2。BNIP3在乳腺癌患者中呈現(xiàn)出抑癌作用，與FTO 的表達呈負相關。BNIP3 能明顯抑制FTO 介導的乳腺癌增殖和轉移。FTO在乳腺癌中或許能成為一個新的治療靶標［17］。

（5） FTO 與非小細胞肺癌 mRNA m6A 去甲基化酶FTO 在非小細胞肺癌中高表達，m6A 修飾水平降低。敲低FTO能在體外或體內(nèi)抑制癌細胞系的增殖、克隆形成或裸鼠成瘤。FTO 能去除泛素蛋白特異性蛋白酶7（ubiquitin specific peptidase 7，USP7）的m6A 甲基化修飾并增加其mRNA的穩(wěn)定性。USP7的mRNA水平在人肺癌組織中高表達，并且與FTO的mRNA 水平呈正相關。敲低或使用抑制劑P5091或P22027降低USP7的水平，能抑制肺癌細胞系的增殖、克隆形成。敲低FTO引起的肺癌細胞系增殖緩慢能被USP7的過度表達而回補修復。因此，mRNA m6A 去甲基化酶FTO 能通過增加USP7的表達促進非小細胞肺癌的發(fā)展［18］。

（6） FTO 與肺鱗癌 通過分析癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫得知FTO 與肺鱗癌的預后相關。與其他的m6A 修飾酶（如METTL3、METTL14、ALKBH5）相比，F(xiàn)TO 能特異性地引起肺鱗癌中m6A 修飾異常。敲低FTO能抑制肺鱗癌細胞系的增殖和侵襲，促進細胞凋亡。反之，過表達野生型FTO而不是其突變體，能促進肺鱗癌細胞系的惡性表型進展。FTO通過去甲基化髓系鋅指1 （myeloid zinc finger 1，MZF1）的m6A 修飾并增加其mRNA 的穩(wěn)定性來促進肺鱗癌的發(fā)展［19］。

2.1.2 FTO抑制劑

目前，已有文獻［20-30］報道了一些有效的FTO 抑制劑（表1）。甲氯芬那酸（meclofenamic acid，MA）能與FTO而不是ALKBH5 競爭性地結合含有m6A 的RNA，從而間接并選擇性地抑制FTO 的活性［20］。 恩他卡朋（entacapone）在體外能直接結合并抑制FTO 的活性。在飲食誘導的肥胖小鼠模型中，飼喂恩他卡朋，叉頭盒O1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）mRNA 作為FTO 的直接作用底物，能誘導肝內(nèi)糖原異生和脂肪組織生熱作用，導致小鼠體質量減輕、空腹血糖濃度降低［21］。小分子抑制劑FB23 和FB23-2 能直接結合FTO 并選擇性地抑制FTO 的m6A 去甲基化酶活性。在體外，使用FB23-2 抑制FTO 的表達，能顯著地抑制人AML 細胞系和原代AML 細胞的增殖并促進其分化和凋亡；在小鼠移植模型中，F(xiàn)B23-2能顯著抑制人AML 細胞系和原代細胞的惡性進展。該結果提示FTO 能作為一個藥物靶標，靶向FTO 的小分子抑制劑展現(xiàn)出了治療AML的潛能［22］。

表1 FTO的抑制劑及其作用方式Tab 1 Inhibitors of FTO and their modes of action

2.2 ALKBH5與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關系及其抑制劑

ALKBH5 傾向于結合特異性的m6A 修飾的單鏈RNA催化其去甲基化。ALKBH5 定位于細胞核內(nèi)的亞細胞器——核小斑，提示其可能參與RNA 前體的可變剪接，ALKBH5基因敲低能促進mRNA 出核，ALKBH5敲除還與精子發(fā)育密切相關［6］。ALKBH5基因在惡性膠質瘤中通過維持叉頭盒M1（forkhead box M1，F(xiàn)OXM1）的表達和細胞增殖來維持其中干細胞樣細胞的致腫瘤性，降低ALKBH5基因表達將顯著抑制腫瘤的生長［31］。

Imidazobenzoxazin-5-thione MV1035 是ALKBH5 的抑制劑，能抑制ALKBH5 在惡性膠質瘤細胞系U87 中通過下游蛋白——細胞外5′核苷酸酶（ecto-5′-nucleotidase，CD73）發(fā)揮的促進腫瘤遷移和侵襲的作用［32］。

2.3 METTL3與腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關系及其抑制劑

METTL3通常與其同源家族蛋白METTL14以1∶1的比例形成異源二聚體，再和WTAP 形成復合物發(fā)揮甲基化催化功能。WTAP 為RNA 結合蛋白，首先結合到RNA上，進而招募METTL3和METTL14行使催化功能。它們?nèi)咧g存在直接的相互作用，共定位于富含剪切因子的細胞核內(nèi)的亞細胞器核小斑上。METTL3 是它們?nèi)咧凶钤绫昏b定的RNA m6A 甲基轉移酶，關于其在腫瘤等疾病中的作用已有報道［33-36］。

在AML 中，定位到轉錄起始位點（transcriptional start site，TSS）的CCAAT 增強子結合蛋白ζ（CCAAT enhancer binding protein ζ，CEBPZ）能招募METTL3 結合到染色體上靶基因的啟動子TSS 上，進而METTL3 能使這些靶基因mRNA 編碼區(qū)產(chǎn)生m6A 甲基化修飾，增強翻譯，促進AML 發(fā)展。下調METTL3 能引起細胞周期阻滯、白血病細胞分化，并能阻止免疫缺陷小鼠形成白血病［33］。METTL3 能抑制造血干/祖細胞分化并促進其增殖。在AML 中，METTL3 高表達，METTL3 生成的m6A促進MYC 原癌基因、bHLH 轉錄因子（MYC protooncogene，bHLH transcription factor，c-MYC）、BCL2 凋亡調節(jié)子（BCL2 apoptosis regulator，BCL2）、同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的翻譯，促進AML 發(fā)展。METTL3 缺失導致AKT 絲氨酸、蘇氨酸激酶（AKT serine/threonine kinase，AKT）的磷酸化增加，使AML 細胞分化和凋亡，延緩AML 進程［34］。在胃癌中，METTL3 介導的肝素結合生長因子（heparin binding growth factor，HDGF）的m6A 修飾增多，導致血管生成和糖酵解增加，從而促進胃癌的生長和肝轉移［35］。在肝癌中，METTL3 高表達并能甲基化細胞因子信號2 的抑制子（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2） RNA 使其被m6A 修飾，甲基化的SOCS2RNA易被YTHDF2 介導降解，從而促進肝癌的生長和轉移［36］。

METTL3 可能成為腫瘤治療的一個重要的藥物靶點，但目前關于其小分子抑制劑的研究較少。有學者通過篩選它的甲基化供體SAM 的類似物和衍生物庫，選取了其中6 種進行了蛋白晶體學的驗證，發(fā)現(xiàn)其中有2 種有較好的配位基活性［37］。

3 展望

目前關于m6A 修飾在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要性越來越明確，某些抑制劑展現(xiàn)出臨床應用潛能，但是對于其在膽囊癌中的研究較少。膽囊癌是一種常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，易轉移，患者預后非常差。本課題組通過全基因組測序和外顯子測序發(fā)現(xiàn)了膽囊癌中的基因組變異，尤其是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，ErbB）通路上的突變，其中erb-b2 受體蘇氨酸激酶2 和3（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2/3，ERBB2/3）的突變能促進CD274分子（PD-L1）介導的膽囊癌免疫逃逸［38-39］。 我們對RNA 上的5- 甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）修飾在膽囊癌中的調控作用與分子機制開展了研究，發(fā)現(xiàn)RNA m5C 甲基轉移酶NOP2/Sun RNA 甲基轉移酶2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2，NSUN2）協(xié)同核糖體蛋白大亞基6（ribosomal protein L6，RPL6）促進了膽囊癌的增殖［40］。NSUN2 在膽囊癌中高表達，能促進膽囊癌細胞系的增殖和克隆形成，促進裸鼠皮下成瘤。NSUN2 和RPL6 存在相互作用，敲低RPL6能夠降低NSUN2 的蛋白水平，并能抑制膽囊癌細胞系的增殖和克隆形成；同時回補NSUN2，能修復膽囊癌細胞系的表型。此外，我們對RNA m5C 修飾在膽囊癌中的修飾譜以及分子機制開展了一定的研究。

RNA m6A 修飾在膽囊癌中的調控作用目前還沒有報道，這可能是未來膽囊癌表觀遺傳調控的一個研究方向。目前我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些RNA m5C 和m6A 修飾互相調控的證據(jù)。這2種修飾對膽囊癌的共同調控也是未來的一個研究方向，將為靶向RNA 修飾在膽囊癌的精準治療提供理論支持。

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