劉景景，胡慧潔，劉子楷，宋明柯

上海交通大學基礎醫(yī)學院藥理學與化學生物學系，上海200025

膠質瘤是臨床上常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中惡性程度較高的膠質母細胞瘤占全部膠質瘤患者的一半以上［1］。近年來，膠質母細胞瘤的手術切除、放射治療和化學治療（化療）等手段取得了一些進展，但是對患者總體生存率的改善非常有限［2］。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是膠質瘤臨床治療的常用化療藥，但膠質母細胞瘤對TMZ 耐藥嚴重，成為膠質瘤化療失敗的主要原因［3］。因此迫切需要開發(fā)新的治療藥物和方法。

細胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）在決定細胞命運中起重要作用，在腦腫瘤研究中也受到越來越多的關注［4-7］。Na+/Ca2+交換體（Na+/Ca2+exchanger，NCX）是一種Ca2+轉運蛋白，參與維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)。NCX 的激活是細胞內(nèi)Ca2+外排的主要途徑，可保護大鼠膠質瘤C6 細胞免受化學性低氧（無糖培養(yǎng)基中加入寡霉素和2-脫氧-D-葡萄糖而造成的細胞缺氧環(huán)境）引起的損傷［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)NCX 阻滯劑bepridil 和KB-R7943 可引起Ca2+介導的膠質母細胞瘤細胞損傷。但是，bepridil 和KB-R7943 對NCX的選擇性相對較低，它們還阻斷鉀離子通道和受體型離子通道［10-12］。阻滯NCX 的抗腫瘤策略在治療膠質母細胞瘤方面具有較好的前景，仍需開發(fā)選擇性更高的阻滯劑。NCX 的轉運模式受細胞膜電位和膜兩側Ca2+和Na+濃度的影響。NCX 的3 種異構體均能以正向（Ca2+外排）或反向（Ca2+內(nèi)流）轉運模式工作。5-（N-4-氯芐基）-N-（2'，4'-二甲基）氨苯蝶啶（CB-DMB）是一種選擇性較高的NCX 雙向轉運阻滯劑［13］，已被報道在納摩爾至毫摩爾濃度范圍內(nèi)選擇性地抑制NCX 的活動，同時其對其他離子通道轉運體不起作用［14］。CB-DMB 抑制NCX 的活動會加劇由化學性低氧引起的C6 細胞損傷［8］。本研究觀察CB-DMB 對膠質母細胞瘤細胞活力的影響，探究以NCX 為靶點的策略對于抑制膠質母細胞瘤的有效性，以及CB-DMB 與TMZ 聯(lián)合用藥對TMZ 藥效的增強作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 人膠質母細胞瘤細胞系U87（貨號HTB-14）購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）；膠質母細胞瘤細胞系U251（貨號TCHu 58）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；兒童膠質母細胞瘤細胞系SF188 來自上海交通大學基礎醫(yī)學院唐玉杰研究員和美國斯坦福大學醫(yī)學院Yoon-Jae Cho教授的饋贈［15］。以上細胞系均由本實驗室擴增和保存。人星形膠質細胞（貨號1800）購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 自動酶標儀（Molecular Devices，美國），Leica TCS SP8 共聚焦系統(tǒng)（Leica Microsystems，Wetzlar， 德國）， Odyssey Fc 成像系統(tǒng)（LI-COR Biosciences，美國），Coulter CytoFlexS 流式細胞儀（Beckman Coulter，美國）。

1.1.3 主要試劑及材料 CB-DMB（貨號C5374）購自美國Sigma Aldrich公司。YM-244769（貨號4544）、SN-6（貨號2184）、SEA0400 （貨號6164） 購自美國Tocris Bioscience 公司。DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司，星形膠質細胞培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技有限公司。Cell counting kit-8（CCK-8）和Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購自日本Dojindo 公司。鈣成像染料Fluo-4 AM 購自美國Invitrogen 公司。胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）、磷酸化JNK （p-JNK）、p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK） 和磷酸化p38-MAPK（p-p38）的一抗以及小鼠α-微管蛋白抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司（貨號分別為4348、8544、9252、9251、9212、9211、2144）。RIPA 緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司。BCA 蛋白質檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上購自美國Millipore 公司。IRDye 680LT 熒光二抗購自美國LICOR Biosciences公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) U87、U251、SF188 細胞在含有L-谷氨酰胺和10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。人星形膠質細胞在補充10% FBS 和星形膠質細胞生長因子的星形膠質細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞均置于5%CO2和飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將NCX阻滯劑溶解在二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中制成儲備液，并稀釋至所需濃度。細胞培養(yǎng)基中DMSO 的體積分數(shù)（φ）為1/1 000，對實驗體系中的細胞活力不會產(chǎn)生影響。研究嚴格參照藥理學研究的相關要求和規(guī)范進行［16］。

1.2.2 細胞活力測定 收集細胞，以5×103個/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。設置實驗組和對照組：實驗組細胞用NCX 阻滯劑孵育48 h，對照組細胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基孵育48 h。每組設置5 個復孔，并進行5 次獨立重復實驗。另設置僅加入細胞培養(yǎng)基的空白孔。之后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育30 min。使用自動酶標儀在450 nm 下測量吸光度值［D（450 nm）］，根據(jù)以下公式計算細胞存活率：細胞存活率= ［（D（450 nm）實驗組-D（450 nm）空白］/［（D（450 nm）對照組-D（450 nm）空白）］×100%。通過GraphPad Prism 7.0 軟件繪制藥物量效曲線圖，計算IC50。藥物濃度和效應關系用公式V/V0×100%=1/｛1+［C/IC50］n｝進行擬合分析，獲得NCX阻滯劑的IC50值，其中V0和V表示對照組和實驗組的細胞活力，C 為藥物濃度，n為希爾（Hill）系數(shù)。

為觀察TMZ與CB-DMB聯(lián)合給藥對細胞生長的影響，收集U87細胞，以5×103個/孔的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)過夜。設置單給藥組和聯(lián)合給藥組：單給藥組用TMZ（100、200、400、800、1 000 μmol/L）或CB-DMB（2.5 μmol/L）單獨孵育細胞48 h；聯(lián)合給藥組則以TMZ（100、200、400、800、1 000 μmol/L）與CBDMB（2.5 μmol/L）共同孵育細胞48 h。細胞存活率計算方法同上。

1.2.3 鈣成像實驗 將細胞以8×103個/孔的密度接種在96 孔板中培養(yǎng)24 h 后，每孔以100 μL 含Ca2+指示劑Fluo-4 AM（終濃度5 μmol/L）的無Ca2+的4-羥乙基哌嗪乙磺酸［4-（2-Hydroxyethyl）piperazine-1-ethanesulfonic acid，HEPES］緩沖液處理50 min。該緩沖液包括135 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、1 mmol/L 乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸［ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA］、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES、1% FBS，pH 值為7.4。U87 細胞與Fluo-4 AM 共孵育1 h 后，將CB-DMB 加入到含2 mmol/L Ca2+和1% FBS 的溶液中。之后將細胞培養(yǎng)板置于Leica TCS SP8 共聚焦顯微鏡下，在將NCX 阻滯劑添加到細胞孔中的同時激發(fā)動態(tài)熒光信號。在室溫下進行熒光成像，進行3 次獨立實驗，每次實驗對22～24 個細胞成像。使用LAS-AF-Lite 2.5 軟件（Leica Microsystems，德國）分析成像數(shù)據(jù)。

1.2.4 Western blotting 收集以CB-DMB 孵育10、30、60和90 min的細胞，在添加蛋白酶抑制劑的RIPA 緩沖液中進行裂解。提取總蛋白，使用BCA 蛋白質檢測試劑盒進行蛋白定量。取45 μg總蛋白上樣，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離后將蛋白質轉移至PVDF 膜上；將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉1～2 h，按照相對分子質量剪開蛋白條帶，放入稀釋好的一抗中孵育，置于4 ℃冰箱搖床上振蕩過夜。一抗孵育結束后用TBST 洗膜3 次，用IRDye 680LT 熒光二抗于室溫下孵育PVDF 膜2 h。使用Odyssey Fc成像系統(tǒng)進行顯色曝光，測定蛋白條帶灰度值，以小鼠α-微管蛋白作為蛋白內(nèi)參。1.2.5 細胞凋亡測定 將U87細胞以1×106個/孔的密度接種至6 孔板中，分別用2.5 μmol/L CB-DMB、330 μmol/L TMZ 孵育細胞。分別孵育6、12、18、24、30、36、48 h后，收集細胞并用預冷PBS 洗2 次，用試劑盒提供的Annexin V 結合溶液制備1×106個/mL 的細胞懸液。取100 μL 上述細胞懸液，向其中加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI工作液；室溫下避光孵育15 min 后，將400 μL Annexin V 結合溶液加至每個樣品中。通過Coulter CytoFlexS流式細胞儀進行細胞凋亡分析。實驗重復5次。使用CyExpert 2.0 軟件（Beckman Coulter，美國）分析數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 7.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示。2組間細胞存活率的比較采用獨立樣本t檢驗，凋亡率的比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），2組間蛋白表達水平的比較用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NCX阻滯劑對膠質母細胞瘤細胞活性的影響

U87、U251 和SF188 細胞分別與0.1、1、2、3 和5 μmol/L CB-DMB 孵育48 h，CCK-8 結果表明CB-DMB有效地抑制了各膠質母細胞瘤細胞的生長活性。在3 μmol/L CB-DMB 作用下，U87、U251 和SF188 細胞的活力約降低至對照組的10%（圖1A）。通過公式擬合分析獲得CB-DMB 對U87、U251 和SF188 細胞的IC50值分別為2.06、2.19 和1.82 μmol/L。U87、U251 和SF188 細胞分別與5、10、20和50 μmol/L的NCX反向轉運阻滯劑共孵育48 h，發(fā)現(xiàn)SN-6、YM244769 和SEA0400 對膠質母細胞瘤的存活率均沒有明顯影響（圖1B～D）。

圖1 4種NCX阻滯劑對膠質母細胞瘤細胞活力的影響Fig 1 Effects of four NCX blockers on the viability of glioblastoma cells

2.2 CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞內(nèi)Ca2+信號的影響

通過Ca2+成像實驗探究CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞內(nèi)Ca2+水平的影響。CB-DMB（2.5 μmol/L和5 μmol/L）灌注后約60 s時，U87細胞內(nèi)Ca2+信號強度顯著增加（圖2），說明細胞內(nèi)Ca2+濃度（intracellular Ca2+concentration，［Ca2+］i）升高。

圖2 CB-DMB對U87細胞內(nèi)Ca2+水平的影響Fig 2 Effect of CB-DMB on intracellular Ca2+level in U87 cells

2.3 CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞內(nèi)MAPK 信號通路的影響

U87 細胞用2.5 μmol/L CB-DMB 孵育10、30、60 和90 min 后，分別檢測ERK、p38-MAPK 及JNK 信號通路蛋白的激活情況。Western blotting 結果顯示，U87 細胞與CB-DMB 孵育10 min 后，p-ERK 蛋白表達水平略有升高，而p-p38 蛋白和p-JNK 蛋白的表達水平顯著上升，相應總蛋白的表達水平未受影響（圖3）。該結果表明JNK 和p38-MAPK 信號通路被激活，可能參與了CB-DMB 誘導的細胞凋亡。

2.4 CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞凋亡的影響

將U87 細胞用2.5 μmol/L CB-DMB 處理6、12、18、24、36 和48 h，發(fā)現(xiàn)凋亡細胞（Annexin V+）的比例隨時間延長而增加（圖4A）。以330 μmol/L TMZ作為對照，在相同的時間點測定U87 細胞凋亡情況，結果顯示，由CB-DMB 引起的細胞凋亡速度較TMZ 更快（P=0.002，圖4B）。

圖3 CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞MAPK信號通路的影響Fig 3 Effect of CB-DMB on MAPK signaling in U87 cells

圖4 CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞的快速殺傷作用Fig 4 Rapid killing effect of CB-DMB on glioblastoma cells

2.5 CB-DMB 聯(lián)合TMZ 對膠質母細胞瘤細胞的生長抑制作用

以100、200、400、800、1 000 μmol/L TMZ 對U87、U251 和SF188 細胞分別處理48 h，發(fā)現(xiàn)TMZ 對細胞的生長抑制作用呈濃度依賴性。經(jīng)過估算，TMZ 對U87、U251 和SF188 細胞的IC50值分別約為801.6、907.4 和331.2 μmol/L。TMZ 與CB-DMB（2.5 μmol/L）聯(lián)合給藥后，發(fā)現(xiàn)TMZ 對細胞生長的抑制作用大大增強，TMZ 對U87、U251 和SF188 細胞的IC50值分別降至約171.5、450.0 和110.0 μmol/L（圖5A～C）。進一步確認CB-DMB對正常人星形膠質細胞是否有毒性，發(fā)現(xiàn)與CB-DMB（3.5 μmol/L）孵育48 h 后星形膠質細胞的存活率降低至對照組的76%，而膠質母細胞瘤細胞（U87、U251 和SF188）的活性則降低至對照組的10%以下（圖5D）。

圖5 CB-DMB對TMZ細胞毒性的增強作用以及CB-DMB對星形膠質細胞活力的影響Fig 5 Enhancement of cytotoxicity of CB-DMB to TMZ and effect of CB-DMB on the viability of human astrocytes

3 討論

膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中常見的原發(fā)性惡性腫瘤，大多數(shù)膠質瘤患者在診斷15～18個月后死亡，高級別膠質瘤目前仍屬于難以治愈的疾?。?7-18］。尋找有效的治療膠質瘤的方法仍是當前急需解決的問題。細胞內(nèi)Ca2+的積累是引起缺血/缺氧細胞死亡的關鍵步驟。細胞內(nèi)升高的Ca2+濃度對腫瘤細胞也可能是致命的。NCX 是一種雙向離子轉運體，可在正向（Ca2+外排）和反向（Ca2+內(nèi)流）2 種模式下工作。阻斷NCX 的正向模式或激活NCX 的反向模式可引起胞內(nèi)Ca2+超載。既往關于NCX 及其阻滯劑的研究主要集中在腦［19-20］和心?。?1-22］等組織缺氧損傷疾病中，以及探討NCX 在神經(jīng)保護方面的價值；但有關NCX 在膠質母細胞瘤進展中的作用的研究較少，更鮮有研究者從Ca2+介導細胞損傷的角度探討NCX 抑制對膠質母細胞瘤生長的殺傷作用。

CB-DMB 是一種對NCX 選擇性較高的阻滯劑，可以阻斷NCX 的2 種工作模式。本研究發(fā)現(xiàn)CB-DMB 對膠質母細胞瘤細胞的體外生長有明顯的抑制作用，且對正常星形膠質細胞的活力影響較小。為了確定NCX 的哪種阻滯模式介導了CB-DMB對膠質母細胞瘤細胞的抑制作用，我們選擇了3 種選擇性抑制NCX 反向轉運模式的阻滯劑——SN-6、YM244769和SEA0400作為對照。這3種化合物可在微摩爾濃度范圍內(nèi)選擇性地阻斷NCX 的反向轉運模式，但對NCX 正向轉運模式不起作用［23-26］。本研究結果發(fā)現(xiàn)：即便把這3 種NCX 反向轉運阻滯劑的濃度（50 μmol/L）提高到CB-DMB 的10 倍，它們對膠質母細胞瘤細胞的殺傷作用也不明顯，推測阻斷NCX的反向轉運模式可能不會引起膠質母細胞瘤細胞的顯著凋亡；但低濃度（2.5 μmol/L）NCX雙向模式阻滯劑CB-DMB即可引起膠質母細胞瘤細胞的快速凋亡，推測CB-DMB 可能是通過阻斷NCX 的正向轉運模式來殺傷膠質母細胞瘤細胞。鈣成像實驗進一步證實，CB-DMB 通過阻滯NCX 的正向轉運模式（Ca2+外排）提高了細胞內(nèi)Ca2+的水平，推測CB-DMB 對膠質母細胞瘤的生長抑制和凋亡誘導作用很可能是由胞內(nèi)Ca2+濃度升高介導的。

已知細胞內(nèi)Ca2+的增加可能直接或間接引起MAPK信號通路的激活［27］。本研究發(fā)現(xiàn)CB-DMB 可導致膠質母細胞瘤細胞內(nèi)p38-MAPK 和JNK 信號通路被激活。p38-MAPK和JNK信號的持續(xù)活化是誘導細胞凋亡的常見分子機制。CB-DMB（2.5 μmol/L）作用6～48 h 導致膠質母細胞瘤細胞凋亡的比例迅速增加，然而TMZ（330 μmol/L）未引起腫瘤細胞明顯的凋亡反應。與TMZ 較緩慢的抗腫瘤作用相比，選擇性阻滯NCX 的正向轉運模式會誘導細胞更快地凋亡；且CB-DMB 與TMZ 合用能增強TMZ 對膠質母細胞瘤的生長抑制作用。由于膠質瘤對TMZ 耐藥的機制較復雜，有關CB-DMB 提高TMZ 敏感性的分子機制還需深入研究。

綜上，CB-DMB 對NCX 的選擇性阻滯作用導致膠質母細胞瘤細胞快速凋亡，并且增強了TMZ 對膠質母細胞瘤細胞的生長抑制作用。細胞膜NCX 可能是治療膠質母細胞瘤的有價值靶標，而NCX 阻滯劑CB-DMB 可用作研發(fā)這一治療策略的先導化合物。

參·考·文·獻

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