付宏煜，謝小芳，范銀銀，朱志宸，徐塑凱，杜鴻(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州215004)

腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯耐藥主要的機(jī)制是產(chǎn)KPC(Ambler A類)、NDM、VIM和IMP(B類)[1]和OXA-48樣(D類)β-內(nèi)酰胺酶[2]。產(chǎn)OXA-48樣碳青霉烯酶腸桿菌科在不同生態(tài)系統(tǒng)中的快速傳播給臨床帶來巨大挑戰(zhàn)[3]。目前已報道的OXA-48樣碳青霉烯酶包括OXA-48[4]、OXA-162[5]、OXA-181[6]、OXA-204[7]、OXA-232[8]、OXA-244[9]、OXA-245[9]、OXA-247、OXA-436、OXA-484、OXA-519。其中，OXA-232在中國最普遍[10]，與國外常見OXA-48樣酶的流行趨勢不同[11]。近年來，OXA-232樣腸桿菌科在中國開始出現(xiàn)[12-13]，以肺炎克雷伯菌最為常見。我國不同地區(qū)產(chǎn)OXA-232肺炎克雷伯菌(OXA-232-producingK.pneumoniae，OXA-232Kp)的分子流行病學(xué)特征與遺傳環(huán)境所知甚少。

OXA-232Kp的克隆性傳播多次在上海[10，14]、浙江[15]報道，尚未發(fā)現(xiàn)OXA-232Kp在江蘇地區(qū)的報道。本文首次調(diào)查江蘇地區(qū)臨床OXA-232Kp的流行病學(xué)特征，包括藥敏分析、耐藥基因檢測、克隆性及質(zhì)粒的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年9月至2019年9月江蘇地區(qū)5家醫(yī)院(鹽城市第一人民醫(yī)院、蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院、蘇州市立醫(yī)院、張家港市第一人民醫(yī)院和蘇州市吳中人民醫(yī)院)臨床連續(xù)分離的非重復(fù)碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)菌株，根據(jù)2020年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)指南M100，亞胺培南、美羅培南和厄他培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)>2 μg/mL為耐藥，至少對其中一種藥物耐藥的肺炎克雷伯菌判定為CRKP。用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)進(jìn)行菌種鑒定。質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706、大腸埃希菌J53由本實驗室保存。

1.2主要儀器與試劑 MALDI-TOF MS儀(德國Bruker公司)，Phoenix-M50全自動細(xì)菌鑒定儀及配套藥敏板卡、瓊脂糖凝膠核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)分析儀(美國Bio-Rad公司)，PCR擴(kuò)增儀(美國Applied Biosystems公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)，麥?zhǔn)媳葷醿x(法國生物梅里埃公司)；胰蛋白胨、酵母提取物(美國Oxoid公司)，瓊脂粉(美國VETEC公司)，瓊脂糖凝膠粉(西班牙BIOWEST公司)，DL2000分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(日本TaKaRa公司)，美羅培南、亞胺培南(干粉，中國BIOSHARP公司)，生理鹽水、氯化鈉、異丙醇、甘油(國藥集團(tuán))，SYBR Green PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)，低溫臺式高速離心機(jī)(Eppendorf Biophotometer公司)，DNA試劑盒、質(zhì)粒Mini 試劑盒(OMEGA公司)，Illumina MiSeq平臺(美國Illumina公司)。

1.3藥敏試驗 用Phoenix-M50全自動細(xì)菌鑒定儀配套的革蘭陰性桿菌藥敏板測定菌株對常見抗菌藥物的MIC值。藥敏結(jié)果根據(jù)2020年CLSI-M100標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.4碳青霉烯酶表型檢測 根據(jù)2020年CLSI-M100指南，采用改良碳青霉烯酶滅活試驗(mCIM)，同時設(shè)置浸沒于無菌TSB肉湯的美羅培南抗菌藥物紙片和干燥的美羅培南抗菌藥物紙片作為空白對照；質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 和ATCC BAA-1706菌懸液的美羅培南抗菌藥物紙片分別為陽性對照和陰性對照，檢測結(jié)果根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.5耐藥基因檢測 PCR技術(shù)擴(kuò)增碳青霉烯酶表型試驗陽性菌株blaOXA-48-like基因(blaOXA-232，blaOXA-48，blaOXA-181)。引物序列見文獻(xiàn)[16]，由上海生工公司設(shè)計合成。DNA模板制備：取分純后長出的菌落溶于100 μL的EP管中，混勻后置于100 ℃的水中煮沸15 min，取出EP管靜置冰上5 min，20 000 r/min離心2 min，取上清液1.5 μL作為DNA模板。PCR反應(yīng)體系共15 μL，包括模板DNA 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各0.75 μL，2×PCR mixture 7.5 μL，dd H2O 4.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706作為陰性對照，擴(kuò)增陽性產(chǎn)物由上海Sangon公司用3730xl 測序儀進(jìn)行Sanger法測序。測序過程如下：醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物；使用TSR溶解純化后的PCR產(chǎn)物并置于95 ℃熱變性2 min；按測序儀操作說明書安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動灌膠(至測序儀)和建立運(yùn)行的測序順序文件；儀器自動灌膠至毛細(xì)管，1.2 kV預(yù)電泳5 min，按編程次序自動進(jìn)樣，再1.2 kV預(yù)電泳20 min后，7.5 kV電泳2 h；儀器自動分析電泳結(jié)果并輸出測序序列。測序結(jié)果與 GenBank的原序列進(jìn)行比對。

1.6質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移 將待測菌株與受體菌J53的單菌落分別接種1 mL LB液中(含抗菌藥物以抑制雜菌)，置于37 ℃、250 r/min的搖床上震蕩過夜，分別以體積比1∶100轉(zhuǎn)接種于1 mL新鮮LB，培養(yǎng)3～4 h至對數(shù)期，將無菌濾紙片紫外照射30 min，平鋪于普通瓊脂平板上，取供、受體各100 μL混勻滴在濾紙片，37 ℃溫箱培養(yǎng)2 h，1 mL LB洗脫。吸取50～100 μL洗脫液均勻涂布于美羅培南和疊氮鈉的雙抗性平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，通過PCR技術(shù)確定接合子是否含有目的基因，同時通過MALDI-TOF MS儀對接合子進(jìn)行菌種鑒定。

1.7多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 使用文獻(xiàn)報道的引物序列、反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)[17]，PCR法擴(kuò)增肺炎克雷伯菌rpoB、infB、phoE、mhd、pgi、gapA、tonB7個管家基因。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海Sangon公司3730xl測序儀進(jìn)行Sanger法測序，測序結(jié)果與http//www．mlst．net上公布的相應(yīng)等位基因序列比較，獲得該菌株7個管家基因的等位基因譜，提交 MLST網(wǎng)站，確定臨床分離株的序列分型(sequence type，ST)。

1.8脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE) 為確定OXA-232Kp菌株的同源性，對OXA-232Kp分離株進(jìn)行限制性內(nèi)切酶XbaⅠ的PFGE，如文獻(xiàn)[18]所述。利用Gel J軟件相似系數(shù)分析PFGE模式。PFGE圖譜中具有≥85%的遺傳相似性或少于4個片段差異的菌株被認(rèn)為是同一克隆(類型)。菌株(型)與原菌株差異≤3個片段的菌株(型)認(rèn)為是暴發(fā)菌株的一個亞型。

1.9質(zhì)粒的提取與序列分析 質(zhì)粒試劑盒提取含blaOXA-232基因的質(zhì)粒菌株的質(zhì)粒，Illumina MiSeq平臺測序分析，SPAdes軟件對序列拼接，通過plasmidfinder網(wǎng)站比對獲取質(zhì)粒復(fù)制子型。

2 結(jié)果

2.1OXA-232肺炎克雷伯菌 共收集78株CRKP菌株，2株菌株(K.PN6655和K.PN6703)疑似blaOXA-48-like陽性，1株菌株(K.PN6665)疑似blaOXA-232陽性，電泳結(jié)果見圖1。將3株疑似陽性產(chǎn)物送上海生工測序，序列在NCBI Blast比對，結(jié)果顯示3株菌株均攜帶blaOXA-232基因。

注：A，OXA-48擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析；B，OXA-232擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析。K.PN6655、K.PN6703、K.PN6703，待測菌株；ATCC BAA-1706，陰性對照；M，DL 2000 marker。

2株OXA-232Kp菌株來自痰液(66.7%)，1株來自泌尿道(33.3%)，其中有2株肺炎克雷伯菌(K.PN6655和K.PN6703)來自于同一患者，但該患者在2次不同的住院期間感染肺炎克雷伯菌。3株OXA-232Kp對頭孢菌素類、氨曲南、復(fù)方磺胺甲噁唑、喹諾酮類藥物均耐藥，2名患者出院前經(jīng)哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、頭孢他啶、慶大霉素等治療后恢復(fù)。

所有菌株mCIM表型呈陽性。3株OXA-232Kp可同時產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)。所有菌株藥敏結(jié)果、基因型及臨床轉(zhuǎn)歸見表1。

表1 3株OXA-232Kp菌株的藥敏結(jié)果、基因型及臨床轉(zhuǎn)歸

MLST分析均屬于ST15型，基于Gel J分析≥85%的基因連鎖率，分離菌株屬于同一克隆，PFGE圖像見圖2。

圖2 OXA-232Kp菌株P(guān)FGE分析

2.2攜帶blaOXA-232基因的質(zhì)粒周圍環(huán)境 3株菌株質(zhì)粒均不能發(fā)生轉(zhuǎn)移，提示該質(zhì)粒為非接合質(zhì)粒。質(zhì)粒測序表明，攜帶blaOXA-232基因的接合子呈現(xiàn)6 141 bp的質(zhì)粒，屬于ColKp3型，blaOXA-232基因位于一個Tn2013-like基因轉(zhuǎn)位單元，見圖3。

注：陰影部分表示重疊區(qū)域。

Blast分析發(fā)現(xiàn)，該質(zhì)粒與曾在中國東部報道的攜帶blaOXA-232的質(zhì)粒pkNICU5(GenBank accession no.KY454616)質(zhì)粒周圍環(huán)境相同。全基因組測序分析，3株菌株同時攜帶多種耐藥基因RmtF、Arr-2，攜帶rmpA2、icu1相關(guān)毒力基因位于毒力質(zhì)粒上，血清分型屬KL112型，見表2。

表2 OXA-232Kp菌株的攜帶耐藥、毒力基因與血清、質(zhì)粒分型

3 討論

目前，中國是世界上CRE流行較高的國家，除碳青霉烯類酶外，ESBL的產(chǎn)生，特別是CTX-M-15和/或AmpC的產(chǎn)生，以及外膜孔蛋白(OMP)的丟失，都可能導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥。目前已有大量文獻(xiàn)研究產(chǎn)KPC/NDM碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥特征與機(jī)制[19]。近幾年攜帶OXA-48樣碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌在中國出現(xiàn)，并出現(xiàn)院內(nèi)暴發(fā)的案例[20]。

OXA-232是目前全球第3種常見的OXA-48樣碳青霉烯酶，首次報道在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中，分離的大腸埃希菌對所有β-內(nèi)酰胺類(不包括亞胺培南、厄他培南和美羅培南)、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類和四環(huán)素不敏感，肺炎克雷伯菌分離株具有類似的藥敏模式，但對碳青霉烯類藥物具有耐藥性。其耐藥特征與本研究中3株OXA-232Kp菌株耐藥模式基本類似。據(jù)報道，blaOXA-232基因通常位于ISEcp1的下游Tn2013轉(zhuǎn)座元件6 141 bp的ColE型質(zhì)粒上，屬于ColKP3型流行質(zhì)粒，是blaOXA-232基因在全球傳播的主要原因[11]。本研究中OXA-232Kp菌株對碳青霉烯類藥物具有低水平的抗性。所有菌株攜帶blaOXA-232基因的6 141 bp ColKP3型質(zhì)粒，該質(zhì)粒與中國東部其他研究發(fā)現(xiàn)的攜帶blaOXA-232基因的質(zhì)粒高度同源[14]，且無法完成接合轉(zhuǎn)移，推測是非接合質(zhì)粒。全球范圍內(nèi)幾乎所有攜帶blaOXA-232基因的菌株攜帶pOXA-232樣質(zhì)粒(與pOXA-232高度相似或相同的質(zhì)粒)。結(jié)構(gòu)上除Tn2013在ISEcp1的5′端有一個大的缺失，blaOXA-232與blaOXA-181基因的遺傳環(huán)境非常相似，區(qū)別在于一個核苷酸取代(A642T)導(dǎo)致一個氨基酸改變(Arg214Ser)。ISEcp1轉(zhuǎn)座酶活性的缺失最有可能使blaOXA-232穩(wěn)定在pOXA-232樣質(zhì)粒上。迄今為止，Tn2013是唯一報道與blaOXA-232基因相關(guān)的遺傳環(huán)境的轉(zhuǎn)座子。

世界各地曾報道攜帶blaOXA-232基因的pOXA-232質(zhì)粒的肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院暴發(fā)，與blaOXA-232相關(guān)的肺炎克雷伯菌ST15是中國常見的STs之一，例如，ST15型肺炎克雷伯菌在中國醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)和新生兒ICU病區(qū)的傳播[21]。大多數(shù)OXA-232Kp菌株共同產(chǎn)生CTX-M-15和NDM-1[22]。導(dǎo)致中國NICU暴發(fā)的OXA-232Kp(ST15型)也含有不同毒力相關(guān)基因的高毒質(zhì)粒(即pLVPK樣IncHI1B/IncFIB質(zhì)粒)，包括rmpA2[23]。本研究中篩選出2018—2019年江蘇地區(qū)3株ICU病區(qū)分離的OXA-232Kp，MLST分型均屬于ST15型， PFGE分析顯示同一醫(yī)院內(nèi)的克隆性傳播。全基因組測序表明，3株OXA-232Kp菌株同時表達(dá)CTX-M-15與NDM，同時攜帶icuA、rmpA2等毒力相關(guān)基因，莢膜血清分型KL112型。

綜上所述，本文首次調(diào)查江蘇地區(qū)臨床OXA-232Kp(ST15型)的流行病學(xué)數(shù)據(jù)。攜帶blaOXA-232基因的質(zhì)粒具有高度的同源性，表明該6 141 bp的ColE型質(zhì)粒對blaOXA-232基因在中國的流行具有重要作用。