王軍，袁純輝，孫紅，向贇(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院&武漢市婦幼保健院檢驗科，武漢 430016)

宮頸癌為女性生殖系統(tǒng)常見腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女健康[1]。我國宮頸癌發(fā)病率和死亡率均高居世界前列，雖然前期采取了諸多防治措施，使得宮頸癌患者預(yù)后和生存期明顯改善，但隨著社會發(fā)展，我國宮頸癌患者呈現(xiàn)年輕化、城市化的新特征[2]。因此，探明宮頸癌發(fā)病機制具有重要意義。硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)為控制機體氧化還原狀態(tài)平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其中特異存在于線粒體中的Trx2在維持細胞生長、核酸代謝和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵性作用[3]，但其在宮頸癌中表達的研究尚少，故本研究旨在通過對宮頸癌患者、子宮頸上皮瘤樣變患者和健康人對照組進行Trx2表達的檢測，探討其與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，為進一步探究宮頸癌發(fā)病機制提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年8月至2019年12月武漢市婦幼保健院就診的患者及體檢健康者共101例，其中經(jīng)病理學(xué)確診的宮頸癌患者32例，年齡(44.97±6.96)歲；子宮頸上皮瘤樣變患者39例，年齡(43.28±7.08)歲；體檢健康者30例，年齡(42.60±7.92)歲。3組間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌患者診斷符合2018年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[4]，排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者納入前進行過放、化療；(2)合并其他惡性腫瘤、感染、自身免疫性疾病等疾??；(3)患者服用性激素或抗菌藥物；(4)其他臨床資料不全者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核和批準(zhǔn)，倫理審批號：2020R079-E01。

1.2儀器與試劑 5424R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，BY-600C低速離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)，DW-86L338J超低溫冰箱(海爾公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，ABI 7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)，分析純異丙醇、無水乙醇和氯仿購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3標(biāo)本采集及處理 宮頸刷片組織由臨床婦科醫(yī)生按常規(guī)方法進行取材，即用宮頸細胞刷插入宮頸，順時針方向旋轉(zhuǎn)5～8圈，收集宮頸外口和宮頸管的脫落細胞標(biāo)本，裝入專用的細胞標(biāo)本保存液。標(biāo)本經(jīng)4 500×g低速離心10 min，棄上清液，采用Trizol法進行總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Trx2表達檢測 宮頸上皮細胞中Trx2表達水平檢測采用實時熒光定量PCR法進行。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中GenBank提供的人Trx2(NG_046718.1)和人β-actin(NM_001101.3)的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件進行引物序列的設(shè)計，由武漢擎科生物科技有限公司合成。Trx2上游引物:5′-CTTTCAAGACCGAGTGGTCAACAG-3′，下游引物:5′-AGGCCTCCAACTGATCCTCAT-3′；β-actin上游引物:5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游引物:5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′。反應(yīng)體系共20 μL，包括2.0 μL cDNA，10.0 μL SYBR Green Mix，6.0 μL雙蒸水，Trx2上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，β-actin上、下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。所有標(biāo)本均進行3次重復(fù)檢測，以β-actin為內(nèi)參基因進行校正，采用2-ΔCt法計算3組研究對象中Trx2的相對表達量，ΔCt=CtTrx2-Ctβ-actin。

2 結(jié)果

2.13組患者Trx2相對表達水平比較 3組研究對象宮頸上皮細胞中Trx2相對表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=338.2，P<0.000 1)。與健康人對照組(668.44±50.61)相比，宮頸癌患者(251.62±43.77)和子宮頸上皮瘤樣變患者(445.05±55.81)Trx2相對表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=27.31,P<0.000 1;t=13.80，P<0.001)；宮頸癌患者與子宮頸上皮瘤樣變患者兩組間宮頸上皮細胞中Trx2表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.23，P<0.001)。

2.2Trx2表達水平與宮頸癌患者臨床病例特征的關(guān)系 結(jié)果發(fā)現(xiàn),在不同年齡、組織學(xué)類型和腫瘤大小的宮頸癌患者間Trx2表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而與不同分化程度、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同F(xiàn)IGO分期間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 Trx2表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

在機體正常代謝過程中，細胞內(nèi)會產(chǎn)生各種代謝副產(chǎn)物，如活性氧(ROS)等。由于細胞內(nèi)存在多種抗氧化酶系統(tǒng)及清除活性物質(zhì)的小分子，其正常運行維持著細胞內(nèi)ROS平衡狀態(tài)，保證了細胞功能的正常。但當(dāng)機體抗氧化系統(tǒng)失衡或細胞清除ROS能力降低時，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA及DNA遭受氧化損傷，細胞發(fā)生癌變甚至凋亡[5-6]。研究表明，宮頸癌患者體內(nèi)ROS顯著升高，高濃度的ROS造成宮頸上皮細胞持續(xù)性損傷，進一步導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[7-9]。機體產(chǎn)生的ROS主要來源于線粒體，而Trx2是維持線粒體功能正常關(guān)鍵蛋白之一[10]。因此，Trx2可能在宮頸癌發(fā)病致病的過程中扮演著重要作用?；诖?，本研究通過qRT-PCR法檢測3組研究對象宮頸上皮細胞中Trx2相對表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在宮頸癌患者和子宮頸上皮瘤樣變患者宮頸上皮細胞中Trx2表達較健康人對照者顯著降低，這說明宮頸癌及子宮頸上皮瘤樣變患者體內(nèi)清除ROS的抗氧化系統(tǒng)處于失衡抑制狀態(tài)，其中宮頸癌患者宮頸上皮細胞內(nèi)Trx2受抑制更為明顯，同時Trx2表達降低可能對宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程起著促進作用。最新研究表明，宮頸癌中過表達的Trx能夠阻止腫瘤壞死因子-α經(jīng)p53誘導(dǎo)的細胞凋亡，促進腫瘤細胞的增殖[11]，通過藥物靶向Trx抗氧化途徑可作為腫瘤細胞氧化還原狀態(tài)的生物標(biāo)志物[12]。這也表明靶向促進Trx2的表達，進而降低宮頸癌患者體內(nèi)ROS水平，有可能成為宮頸癌治療的一個新方向。

研究已證實人乳頭瘤病毒(human papillavirus，HPV)的感染，尤其是高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的一個重要始動因素，且HPV感染可以促進患者組織微環(huán)境中ROS的產(chǎn)生，誘導(dǎo)慢性氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性，增加DNA損傷的敏感性，導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[13]。動物實驗也表明,基于Trx的L2-E7納米顆粒疫苗可以顯著預(yù)防HPV感染和治療HPV引起的宮頸癌[14]，然由于本研究所收集標(biāo)本中缺乏相應(yīng)HPV感染陰性宮頸癌患者等原因，致本文未研究HPV感染是否是宮頸癌患者體內(nèi)ROS失衡的原因，在后期的研究中我們將進一步擴大對宮頸癌患者標(biāo)本等信息的采集，同時基于相關(guān)細胞、動物實驗對Trx2的調(diào)控機制及相關(guān)生物學(xué)功能的評估還需進一步深入。

本研究還對宮頸上皮細胞中Trx2表達與宮頸癌患者臨床病理特征進行分析，發(fā)現(xiàn)宮頸上皮細胞中Trx2的表達水平與宮頸癌患者年齡、組織學(xué)類型及腫瘤大小無關(guān)，而與腫瘤分化程度、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及FIGO分期密切相關(guān)。這說明Trx2中表達水平的異常降低促進宮頸病變的惡性進展，預(yù)后較差。Trx2可作為臨床宮頸癌腫瘤分化程度與FIGO分期的重要參考指標(biāo)，對宮頸癌的預(yù)后提供重要參考，而且可能是宮頸癌治療的一個潛在靶點，但具體作用機制有待進一步深入研究。