耿幟，徐遠(yuǎn)東，包一熙，陳鳳花(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430022)

應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)呼吸道標(biāo)本中新型冠狀病毒(2019-nCoV)RNA，是診斷新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者以及篩查無(wú)癥狀感染者的主要手段之一，但2019-nCoV核酸檢測(cè)可能受到患者病程、標(biāo)本采集、核酸提取設(shè)備及相應(yīng)試劑、核酸擴(kuò)增試劑及實(shí)時(shí)熒光PCR儀等多種因素的影響[1]。目前有多種2019-nCoV RNA檢測(cè)的RT-PCR試劑盒已獲得中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)緊急使用授權(quán)(EUA)、世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)應(yīng)急使用清單(Emergency Use Listing，EUL)和體外診斷歐盟認(rèn)證(CE-IVD)批準(zhǔn)，不同生產(chǎn)廠家聲稱(chēng)的試劑分析靈敏度不同。對(duì)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床實(shí)驗(yàn)室，為避免產(chǎn)生假陰性結(jié)果，選擇靈敏度高、臨床檢測(cè)性能佳的2019-nCoV RNA檢測(cè)試劑至關(guān)重要[2]。另外，標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間(turnaround time, TAT)也是影響試劑選擇的重要因素。在2019-nCoV核酸檢測(cè)設(shè)備包括核酸提取儀和實(shí)時(shí)熒光PCR儀等資源有限的情況下，縮短PCR擴(kuò)增時(shí)間，有助于縮短TAT，提高實(shí)驗(yàn)室2019-nCoV核酸檢測(cè)能力。本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)性能驗(yàn)證后選擇達(dá)安公司試劑檢測(cè)臨床樣本2019-nCoV核酸，近期該廠家又推出一款擴(kuò)增時(shí)間短的試劑，聲稱(chēng)新試劑分析靈敏度不變，但擴(kuò)增時(shí)間由110 min減少至62 min。為確定是否能將擴(kuò)增時(shí)間長(zhǎng)的試劑更換為擴(kuò)增時(shí)間短的試劑，本研究對(duì)同一廠家生產(chǎn)的這兩種不同2019-nCoV RNA檢測(cè)試劑進(jìn)行臨床性能評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1臨床樣本 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院2020年2月9日發(fā)熱門(mén)診患者130例，其中，男性56例，女性74例；年齡10～90歲，中位年齡48.5歲。

1.2儀器與試劑 GeneRotex 96全自動(dòng)核酸提取儀(蘇州天隆公司)，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒(磁珠法，蘇械備20151030，蘇州天隆公司)，2019-nCoV RNA液體室內(nèi)質(zhì)控品S2[以開(kāi)放讀碼框1ab(open reading frame 1ab,ORF1ab)濃度賦值17 300 copies/mL，溯源到國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)091132/GBW(E)091133，廣州邦德盛公司]，試劑A: 新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法，國(guó)械注準(zhǔn)20203400063)、試劑B: 新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法，國(guó)械注準(zhǔn)20203400749)(中山大學(xué)達(dá)安公司)。

1.3分析靈敏度評(píng)價(jià) 用2019-nCoV陰性混合樣本，梯度稀釋定值質(zhì)控品S2(17 300 copies/mL)至1 730、865、567.7、432.5、216.3和108.2 copies/mL 6個(gè)濃度；按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)EP17-A2，每個(gè)濃度每天做7～8個(gè)復(fù)孔，連續(xù)3 d，共計(jì)23孔，進(jìn)行核酸提取和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增以評(píng)估分析靈敏度。廠家聲稱(chēng)試劑A和B分析靈敏度均為500 copies/mL。

1.4核酸提取 取200 μL咽拭子病毒保存液或不同濃度質(zhì)控品稀釋液，用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒在GeneRotex 96全自動(dòng)核酸提取儀上提取核酸，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將提取的核酸保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.52019-nCoV RNA擴(kuò)增檢測(cè) 試劑A和B檢測(cè)的靶基因均為2019-nCoV ORF1ab基因和核殼蛋白(nucleocapsid, N)基因；檢測(cè)的熒光均為FAM、VIC和Cy5三通道；均檢測(cè)內(nèi)源性?xún)?nèi)標(biāo)，以監(jiān)測(cè)咽拭子樣本采集、核酸提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程的有效性。試劑A和B的PCR反應(yīng)體系總體積均為25 μL，包括17 μL PCR反應(yīng)液A，3 μL PCR反應(yīng)液B，5 μL核酸模板，均在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。試劑A和B的擴(kuò)增條件不同，對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間分別為110 min和62 min。試劑A的擴(kuò)增條件為：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s檢測(cè)熒光，45個(gè)循環(huán)。試劑B的擴(kuò)增條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，10個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s檢測(cè)熒光，32個(gè)循環(huán)。每批次設(shè)3個(gè)陰性質(zhì)控和1個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控。試劑A和B的陽(yáng)性結(jié)果判斷的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)分別為Ct≤40和Ct≤30。

1.6相對(duì)靈敏度評(píng)價(jià) 選取試劑A檢測(cè)ORF1ab和N基因的Ct值為18～27的5例2019-nCoV強(qiáng)陽(yáng)性核酸，用天隆公司的洗脫液進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋[3]，然后同時(shí)用試劑A和B進(jìn)行檢測(cè)，原倍核酸做2個(gè)復(fù)孔，每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，分析不同稀釋度靶基因的檢出率和Ct變化。

1.7臨床檢測(cè)性能比較 試劑A和B同時(shí)檢測(cè)130例咽拭子樣本核酸，分析其陽(yáng)性符合率、陰性符合率等，第一次檢測(cè)結(jié)果為靶基因單陽(yáng)的臨床樣本核酸進(jìn)行雙孔復(fù)查，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)判定結(jié)果。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示，率的比較采用Fisher精確概率法，一致性分析采用Kappa檢驗(yàn)，最低檢測(cè)限采用Probit分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1分析靈敏度評(píng)價(jià) 質(zhì)控品S2的賦值以O(shè)RF1ab為準(zhǔn)。試劑A和B均能100%(23/23)檢測(cè)到濃度為1 730 copies/mL的S2稀釋液中ORF1ab基因，隨著稀釋液濃度降低，ORF1ab的檢出率逐漸降低。試劑A和B檢測(cè)865、567.7、432.5、216.3和108.2 copies/mL的S2稀釋液中ORF1ab基因的陽(yáng)性率分別為95.65%(22/23)和82.61%(19/23)、95.65%(22/23)和78.26%(18/23)、91.30%(21/23)和78.26%(18/23)、65.22%(15/23)和43.48%(10/23)、34.78%(8/23)和17.39%(4/23)。根據(jù)Probit分析，算得試劑A和B的最低檢測(cè)限分別為615.9(95%CI：446.0～1 098.5)copies/mL和1 249.1(95%CI：863.4～2 378.8)copies/mL。

2.2相對(duì)分析靈敏度評(píng)價(jià) 用洗脫液連續(xù)10倍梯度稀釋5例2019-nCoV強(qiáng)陽(yáng)性的臨床樣本核酸進(jìn)行相對(duì)分析靈敏度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，在1∶10和1∶100稀釋時(shí)，試劑A和B均能100%檢測(cè)到ORF1ab和N基因；而1∶1 000稀釋時(shí)，試劑A對(duì)ORF1ab和N基因的檢出率均為100%，試劑B的檢出率分別為73.33%和80.00%，見(jiàn)表1。在原倍、1∶10和1∶100稀釋時(shí)，試劑A檢測(cè)ORF1ab和N基因的Ct分別為24.66±2.34和22.70±2.32、28.38±2.19和26.25±2.22、32.16±2.23和30.07±2.29，試劑B檢測(cè)ORF1ab和N基因的Ct分別為16.35±2.46和14.50±2.35、19.15±2.28和17.93±2.42、22.47±2.35和21.97±2.56；連續(xù)10倍稀釋?zhuān)噭〢和B檢測(cè)ORF1ab和N基因的平均Ct增加2.80～4.04。

表1 2種試劑檢測(cè)5例2019-nCoV強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本不同稀釋度核酸的相對(duì)分析靈敏度[n(%)]

2.32種試劑的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià) 2種試劑檢測(cè)130例咽拭子樣本核酸中2019-nCoV的 ORF1ab和N基因，試劑A第一次檢測(cè)出45例雙陽(yáng)、4例ORF1ab單陽(yáng)、8例N單陽(yáng)和73例陰性，試劑B第一次檢測(cè)出34例雙陽(yáng)、4例ORF1ab單陽(yáng)、6例N單陽(yáng)和86例陰性，每種試劑第一次檢測(cè)的單陽(yáng)繼續(xù)用相應(yīng)試劑雙孔復(fù)查，最終試劑A檢測(cè)出57例(43.85%)2019-nCoV RNA陽(yáng)性、73例(56.15%)2019-nCoV RNA陰性，而試劑B則檢測(cè)出43例(33.08%)陽(yáng)性、87例(66.92%)陰性。經(jīng)Fisher精確概率法檢驗(yàn)，這2種試劑檢測(cè)的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而有1例樣本，試劑A檢測(cè)陰性、試劑B檢出N單陽(yáng)，隨后雙孔復(fù)查為陰性，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)判定為陰性。應(yīng)用Kappa一致性檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)：2種試劑的檢測(cè)結(jié)果一致性較好(kappa=0.775 3)，陽(yáng)性率符合率為75.44%(43/57)，陰性符合率為100%(73/73)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%(43/43)，陰性預(yù)測(cè)值為83.91%(73/87)，總符合率為89.23%(116/130)。

3 討論

本研究進(jìn)行2種試劑的臨床檢測(cè)性能評(píng)價(jià)，以確定能否將試劑A更換為試劑B，縮短TAT、提高核酸檢測(cè)能力。雖然廠家聲稱(chēng)的試劑A和B的分析靈敏度均為500 copies/mL，但是梯度稀釋定值質(zhì)控品進(jìn)行分析靈敏度驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)試劑A和B的分析靈敏度分別為615.9和1 249.1 copies/mL；進(jìn)一步應(yīng)用2019-nCoV陰性混合樣本梯度稀釋5例強(qiáng)陽(yáng)性臨床樣本核酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)試劑A和B 100%檢出ORF1ab和N基因的最高稀釋度分別為1∶1 000和1∶100，這些均提示試劑A的實(shí)際分析靈敏度比試劑B高。有研究應(yīng)用數(shù)字PCR發(fā)現(xiàn)試劑A的分析靈敏度為484 copies/mL[4]，每反應(yīng)體系靈敏度為1～10 copies[5]，與本研究發(fā)現(xiàn)的試劑A分析靈敏度615.9 copies/mL稍有差異，可能是由于定值的溯源性不同以及梯度稀釋的基質(zhì)不同等因素所致。

對(duì)于130例咽拭子樣本核酸，試劑A檢出的陽(yáng)性率43.85%顯著高于試劑B的陽(yáng)性率33.08%，其中有14例樣本試劑A檢出陽(yáng)性而試劑B漏檢，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這14例樣本應(yīng)用試劑A檢測(cè)到ORF1ab或N基因的Ct大多為36～40，可能是由于試劑B的實(shí)際分析靈敏度低于試劑A所致。應(yīng)用Kappa一致性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：試劑A和B的檢測(cè)結(jié)果一致性較好(kappa=0.775 3)，陽(yáng)性符合率為75.44%，陰性符合率為100%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100%，陰性預(yù)測(cè)值為83.91%，總符合率為89.23%，提示試劑A和B的臨床檢測(cè)性能存在差異。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)2種2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑的臨床性能之間存在差異。為保證2019-nCoV核酸的檢測(cè)質(zhì)量，不宜將擴(kuò)增時(shí)間長(zhǎng)的試劑更換為擴(kuò)增時(shí)間短的試劑。