于泓川，何懋典，劉 鵑，李軍霞，帥 逸，臧圣奇，金 磊

外傷、感染、先天畸形、原發(fā)性疾病、藥物治療或手術(shù)切除腫瘤均可導(dǎo)致骨缺損的產(chǎn)生。有統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美國每年單獨治療骨缺損的費用高達50億美金，骨缺損治療配套的腫瘤、骨恢復(fù)、愈合不良治療的費用更是不計其數(shù)[1]。成本高昂的自體骨及同種異體骨是骨缺損修復(fù)的最佳代用品，但自體骨存在數(shù)量受限、二次創(chuàng)傷及術(shù)后吸收的問題，同種異體骨也往往有免疫排斥、感染傳播的風(fēng)險。因此，設(shè)計人工骨修復(fù)策略的骨組織工程應(yīng)運而生，并在最近幾十年受到了極大關(guān)注。

在過去的60年中，植入物的表面技術(shù)已經(jīng)從生物惰性表面(例如鈦和鉭)發(fā)展到生物活性表面(例如等離子噴涂的羥基磷灰石和其他陶瓷)，再到最新的下一代仿生工程納米技術(shù)[2]。其中關(guān)于二氧化鈦(TiO2)納米管的研究展示了巨大潛力。TiO2納米管一般通過陽極氧化法生成于純鈦表面，直徑為納米級，它將平坦表面變成微觀立體，極大地增加了接觸面積，并可調(diào)控細胞行為。成型的TiO2納米管比Ti表面更能促進細胞粘附、成骨分化、礦化，并有更強的抗菌性能[3-4]，有人在兔體內(nèi)的實驗發(fā)現(xiàn)TiO2納米管使骨結(jié)合強度提高了9倍[5]。

雖然陽極氧化法可以對納米管的長度、直徑和陣列進行調(diào)控，但這種方法產(chǎn)生的最終產(chǎn)品受到鈦金屬機械性能和各類成本的限制，同時產(chǎn)品外觀多為平板和柱狀，無法適應(yīng)骨組織工程的多元化仿生需求，例如模擬骨小梁的三維結(jié)構(gòu)和機械性能。不可吸收骨骼支架需要良好連通的微米級孔隙網(wǎng)絡(luò)，以便物質(zhì)運輸、血管化和組織滲透生長，為功能性活骨形成提供足夠的條件[6]。不過，多數(shù)不可吸收多孔支架的機械性能尚未令人滿意，可吸收支架應(yīng)用時更要額外考慮降解速率對成骨產(chǎn)生的影響[7]。

二氧化鋯(ZrO2)是一種不可吸收的生物相容陶瓷材料，具備優(yōu)異的機械強度和韌性。課題組前期通過模板法制作了多孔ZrO2支架[8]，很好地模擬了骨小梁的多孔結(jié)構(gòu)和機械性能。

人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是一種間充質(zhì)干細胞，廣泛地存在于人牙齒內(nèi)的活體牙髓中，可多向分化、自我更新，同時具備取材便捷、免疫原性低的特征，是再生組織工程的潛力細胞[9]。本課題組對hDPSCs的取材、培養(yǎng)、分化已經(jīng)積累了一定的經(jīng)驗，并曾通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)對其部分成骨基因完成了轉(zhuǎn)染[10-11]。

因此，本實驗利用水熱合成將TiO2納米管成型于ZrO2三維多孔支架表面并形成陣列，使兩者的生物學(xué)和機械性能優(yōu)勢結(jié)合，制造出毫米級、微米級、納米級分層滿足骨修復(fù)多層次需求的骨組織工程材料，并結(jié)合使用hDPSCs探究其對于干細胞粘附和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 納米ZrO2支架的制備

將定形好的聚氨酯模版(1 cm×1 cm×0.5 cm，60 ppi)浸泡于2 mol/L的NaOH中8 h后取出，生理鹽水沖洗，烘箱(精宏，中國)40 ℃干燥。超聲水浴條件下，按照粉液質(zhì)量比2∶3將釔穩(wěn)定納米ZrO2粉(Tosoh，日本，粒徑29 nm，純度94.46%)少量多次加入混合溶液(250 μL 質(zhì)量分數(shù)5%PVB乙醇溶液∶1 mL 95%乙醇溶液∶1 mL去離子水)中得到質(zhì)量濃度60%的納米ZrO2均勻液態(tài)漿料。聚氨酯模板在ZrO2漿料中浸潤后離心機離心3 s去除多余漿料，40 ℃烘箱中干燥24 h后放入燒結(jié)爐(科晶，中國)，2 ℃/min升溫至660 ℃并保持30 min，10 ℃/min升溫至1 360 ℃后持續(xù)180 min，再0.5 ℃/min降溫至1 060 ℃后自然降溫。進行再次燒結(jié)(重復(fù)4次)：支架浸入漿料、吹堵孔、干燥后燒結(jié)，10 ℃/min升溫至1 360 ℃，再1 ℃/min升溫至1 400 ℃并保持180 min，5 ℃/min降溫至800 ℃后自然降溫。

1.2 納米TiO2漿料涂層及支架的燒結(jié)

整個過程與ZrO2漿料類似，只是溶質(zhì)為TiO2納米粉末(阿拉丁，中國，粒徑25 nm，純度99.8%，金紅石)，配制得到質(zhì)量分數(shù)5%、15%、30%的TiO2均勻液態(tài)漿料。同樣的燒結(jié)前準備后燒結(jié)，5 ℃/min升溫至500 ℃并保持120 min后自然降溫。

1.3 TiO2納米管的形成

將冷卻后的支架浸泡在水熱反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)膽中的NaOH溶液(10 mol/L)，密封反應(yīng)釜后放入高溫爐以5 ℃/min加熱至110 ℃并保持12、24、36 h，自然冷卻至室溫，去離子水反復(fù)沖洗至沖洗液pH=7。烘箱40 ℃干燥24 h。

1.4 收縮率

使用數(shù)顯卡尺(廣陸，中國)測量待測支架長、寬、高，計算其體積。使用成型支架平均體積V1除以聚氨酯模版平均體積V2得到其收縮率。

1.5 孔隙率

利用比重瓶法測定支架孔隙率。加滿三蒸水的比重瓶稱重W1，待測支架干重W2。將支架浸入比重瓶的水中，靜置24 h使氣泡排出。使用三蒸水加滿比重瓶測重W3，取出飽含三蒸水的支架，稱取比重瓶剩余重量W4?？紫堵视嬎愎饺缦?。

1.6 壓縮強度

測量每個樣品的尺寸，輸入程序；將待測樣品放入電子萬能材料試驗(Instron3365，美國)樣品臺，上下墊紙，設(shè)定機頭加載速度為0.5 mm/min，施加負荷直至試樣破壞。記錄最大強度數(shù)值。

1.7 掃描電子顯微鏡(SEM)和能譜儀(EDS)

支架表面噴金至少40 s后置于電鏡托盤上，使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Quanta 250FEG，美國)觀察表面形態(tài)，并通過配套能譜儀(Oxford Instruments，英國)分析成分。

1.8 拉曼光譜(LRS)

通過拉曼光譜儀(Horiba，法國)，利用 100～800 cm-1的拉曼譜掃描各組樣品表面。

1.9 細胞培養(yǎng)

將支架放入48孔板中，每個樣品使用普通培養(yǎng)基浸泡12 h之后，吸出培養(yǎng)基，滴入約5×105個培養(yǎng)3代的hDPSCs。放入培養(yǎng)箱(力申，中國)6 h之后，每孔加入含10%比例胎牛血清的培養(yǎng)基0.5 mL，每2 d換液。hDPSCs由臨床患者拔除的第三磨牙中獲取，已通過患者知情同意。

1.10 SEM和鬼筆環(huán)肽觀察粘附細胞形態(tài)

接種6 h后，使用PBS洗滌3次后，細胞固定液(碧云天，中國)常溫下固定30 min，細胞洗滌液(碧云天，中國)洗滌3次，每次配合搖床晃動5 min。a. 使用 10%、30%、50%、80%、95%、100%(2次)的乙醇層級脫水各10 min，冷凍干燥機干燥12 h。常規(guī)SEM處理及觀察。b. 將1∶100的二抗稀釋液(碧云天，中國)每孔滴入300 μL，室溫避光孵育 30 min后，PBS配合搖床洗滌3次，每次5 min，共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)下觀察細胞形態(tài)。

1.11 CCK-8檢測細胞增殖能力

使用 CCK-8(諾唯贊，中國)試劑盒檢測3、5、7 d樣品，按照產(chǎn)品說明書每孔加入300 μL檢測液,處理2 h后，吸出100 μL進行酶標儀(Tecan，荷蘭)檢測。

1.12 堿性磷酸酶檢測細胞成骨分化能力

利用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)細胞，按照產(chǎn)品說明書使用堿性磷酸酶(ALP)檢測盒(碧云天，中國)檢測實驗組和對照組4、7 d ALP活性。

1.13 統(tǒng)計分析

格拉布斯準則去除極端值，Shapiro-Wilk test驗證各組正態(tài)齊性，Bartlett-test檢驗組間方差齊性，使用ANOVA進行方差分析，多組樣本之間使用Tukey test對比差異。每組有效樣本不少于3個，P<0.05計為有統(tǒng)計學(xué)差異。統(tǒng)計分析及作圖均使用R(version 3.6.3)進行。

2 結(jié) 果

2.1 成品支架成型

聚氨酯膜版(圖1A)通過一系列處理最終得到了多孔蜂窩狀立方體目標支架，肉眼觀支架為淡黃色，與模板形狀相似且無明顯堵孔(圖1B)。15個樣品支架長、寬、高平均為7.35 mm、7.49 mm、4.42 mm，對比初始模板體積收縮率約為48.4%。場發(fā)射電子顯微鏡低倍觀測到支架孔徑為230～820 μm，且無堵孔、表面光滑、無明顯裂痕(圖1C)。

A：成型的聚氨酯模版；B：15%TiO2涂層支架；C：SEM( ×120)觀察15%TiO2涂層支架

2.2 各組微觀表面及元素分析

掃描電子顯微鏡高倍觀察個組樣品，可發(fā)現(xiàn)NaOH處理時長和涂層TiO2濃度均影響表面形態(tài)，15%TiO2涂層NaOH處理24 h的樣品表面觀測到了成型的TiO2納米管陣列。

NaOH處理12 h僅在緊密連接的ZrO2陶瓷顆粒表面形成分散的指狀凸起，反應(yīng)底物(TiO2)越充足，凸起結(jié)構(gòu)越密集(圖2A、D、G)。即使NaOH處理時間延長，5%組樣品仍是分散的指狀凸起(圖2B、C)。反應(yīng)底物充足的樣品，過長的NaOH處理時長會使表面結(jié)構(gòu)雜亂化(圖2F、I)。預(yù)期的管樣陣列結(jié)構(gòu)出現(xiàn)于底物充足、反應(yīng)時長24 h的樣品(圖2E、H)。15%TiO2涂層NaOH處理24 h的樣品表面結(jié)構(gòu)最優(yōu)，類似玫瑰花瓣的管壁組成了不規(guī)則蜂窩樣陣列結(jié)構(gòu)，孔徑100～800 nm不等(圖2E、圖4D)。EDS對表面元素的分析證實了底層支架Zr成分。同時TiO2涂層濃度越高，對Zr元素掩蓋作用越明顯(圖2G、K、L)。

A～I：SEM( ×24 000)觀察各組表面納米形態(tài)；J～L：EDS分析5%、15%、30%TiO2涂層表面的元素比例

2.3 壓縮強度和孔隙率

經(jīng)過萬能試驗機測試，發(fā)現(xiàn)最終支架有兩種典型的壓縮強度-位移關(guān)系曲線(圖3A)。第Ⅰ類出現(xiàn)最大斷裂強度后壓縮強度急劇下降，第Ⅱ類最大壓縮強度較第Ⅰ類低，沒有明顯的強度驟降。復(fù)合TiO2后樣品的機械強度與原有ZrO2支架組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，約為1.5 MPa(圖3B)，但雙因素方差分析發(fā)現(xiàn)5%類樣品與15%類樣品的壓縮強度存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。利用比重瓶法對比各組孔隙率，各組孔隙率值均約80%左右，各組之間均無明顯差異(P>0.05)(圖3C)。

A：本實驗全部支架的兩類特征性壓縮強度-位移曲線圖；B：各組壓縮強度；C：各組孔隙率；*：P<0.05

2.4 微管晶型鑒定

LRS檢查了ZrO2支架組、15%TiO2涂層組(未經(jīng)NaOH處理形成納米管)和納米管組型樣品的晶體結(jié)構(gòu)(圖4A)，并聯(lián)合SEM分析結(jié)果。純ZrO2陶瓷顆粒(圖4B)在145 cm-1、259 cm-1和643 cm-1處顯示拉曼峰。用TiO2覆蓋表面后(圖4C)，僅有金紅石型TiO2的237 cm-1、445 cm-1和609 cm-1特征峰[12]。當(dāng)納米管形成后(圖4D)，兩個物質(zhì)的拉曼光譜重疊并且金紅石相的TiO2拉曼反射表現(xiàn)較弱。

A：拉曼光譜儀(100～800 cm-1)檢測ZrO2支架組、15%TiO2涂層組、納米管組樣品；B～D：掃描電鏡( ×30 000)觀測ZrO2支架組、15%TiO2涂層組、納米管組樣品

2.5 hDPSCs細胞粘附

將未形成納米管的樣品(圖4C)設(shè)為對照組，納米管成型樣品(圖4D)設(shè)為實驗組，兩者的唯一不同在于是否經(jīng)過NaOH處理形成TiO2微管。hDPSCs接種6 h后，通過SEM看到對照組表面細胞團塊呈無形態(tài)的攤平樣貌(圖5A)，實驗組表面有細胞絲狀偽足散布在納米管陣列的孔中，與表面空隙形成了互鎖的細胞結(jié)構(gòu)(圖5B)。利用鬼筆環(huán)肽可染色細胞肌動纖維骨架[13]，接種后6 h的染色圖片也觀測到了實驗組呈現(xiàn)出更為明顯的紡錐狀骨架伸展(圖5C、D)。

A、B：SEM( ×4 000)觀察對照組及實驗組表面，實驗組附帶局部放大細胞偽足；C、D：鬼筆環(huán)肽染色后共聚焦顯微鏡( ×200)觀察對照組及實驗組

2.6 hDPSCs細胞增殖和成骨活性

CCK-8檢測3、5、7 d的OD值表明兩組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖6)。但是在成骨誘導(dǎo)液的培養(yǎng)條件下，ALP檢測表明實驗組細胞4、7 d的ALP活性較實驗組明顯增高(P<0.05)。

A：CCK-8檢測法對各組進行細胞定量；B：實驗組和對照組的ALP活性；*P<0.05

3 討 論

骨組織工程領(lǐng)域的研究目標是設(shè)計出優(yōu)于自體骨和同種異體骨的外源性骨修復(fù)策略，因此必須從疾病損傷和治療的角度，進行材料、制造方法和應(yīng)用途徑的選擇[14]。

從臨床角度考慮，骨組織本身足以愈合小的骨缺損及裂紋，但是超出閾值的缺損往往不能較好地恢復(fù)。一般認為這個閾值為直徑2.5 cm，超過閾值則需要骨組織工程材料的幫助[15]。成型的不可吸收骨替代材料能夠在缺損處提供空間支撐、時間維持和應(yīng)力配適，進而幫助機體早期承力、美學(xué)恢復(fù)和遠期功能行使，同時不會因溶解或吸收而產(chǎn)生代謝物質(zhì)、造成局部微環(huán)境改變，是當(dāng)下不可替代的一種骨修復(fù)策略。

本實驗采用的ZrO2及TiO2具備良好的生物安全性，已經(jīng)臨床使用多年[16]。本復(fù)合支架的兩類斷裂曲線(圖3A)與小梁結(jié)構(gòu)固有形態(tài)有關(guān)。表面小梁均勻的支架整體受力并在碎裂前形成壓縮強度高點，符合第Ⅰ類曲線。而有些支架表面小梁結(jié)構(gòu)不均勻?qū)е路謮K碎裂，不能呈現(xiàn)整體受力的最大機械強度，表現(xiàn)為第Ⅱ類曲線。TiO2的燒結(jié)溫度約為1 450 ℃，本方法的處理溫度最高為500 ℃，僅去除漿料內(nèi)的有機雜質(zhì)，不能使TiO2顆粒致密化形成陶瓷層，因此無法明顯增強支架強度(圖3B)。15%TiO2涂層NaOH處理24 h的樣品，底物充足、反應(yīng)時長適中，表面觀測到了成型的孔徑100～800 nm的TiO2納米管陣列(圖2E)，其空管樣的結(jié)構(gòu)極大減弱了對拉曼波的反射，并且使底層ZrO2暴露于拉曼波(圖4A)。陣列略微增加原支架壓縮強度至1.76 MPa，接近骨松質(zhì)2～12 MPa的固有性能[17]。而相對過量的NaOH強堿溶液腐蝕了5%TiO2涂層組并降低了其機械強度，因此造成這兩個變量樣品出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(圖3B)。最終支架預(yù)期可形成較好的應(yīng)力傳遞，減少骨-修復(fù)體結(jié)合界面不良應(yīng)力集中及界面組織損害，優(yōu)化患者體驗和使用年限。滿足機械強度的同時，支架具備相互交聯(lián)的孔網(wǎng)絡(luò)，約80%的孔隙率很好地模擬了骨小梁50%～90%孔隙率的特征[6]。230～820 μm滿足物質(zhì)交換及血管向內(nèi)生長的需求，細胞、神經(jīng)和血管的進入和持續(xù)停留將對于骨組織的重塑產(chǎn)生重要積極影響[18]。

本實驗也證實，此支架方便運輸，并且可通過臨床常見的高溫蒸汽或酒精浸泡消毒處理。在制造成本低的同時，無額外運輸、臨床處理成本，不存在供體感染風(fēng)險。

機體內(nèi)的細胞行為依賴于它們與細胞外基質(zhì)(ECM)的相互作用[19]。人造底物表面上的納米特征可以與天然ECM相同的方式影響蛋白及細胞粘附、細胞增殖、細胞生化功能甚至細胞分化[20]。蛋白吸附是材料和機體之間的首次交互，影響后續(xù)細胞行為。陽極氧化法生產(chǎn)的TiO2管一般為銳鈦型，有人發(fā)現(xiàn)經(jīng)過特殊處理得到的金紅石型更有利于血清蛋白粘附[21]。同時，細胞表面的整聯(lián)蛋白與早期附著息息相關(guān)，附著過程的關(guān)鍵是力高度敏感的納米管-整聯(lián)蛋白-細胞骨架連鎖反應(yīng)[22]。表面納米結(jié)構(gòu)孔徑?jīng)Q定了細胞表面粘附蛋白的點位和間距，兩者之間的粘附力分散在整聯(lián)蛋白上并傳遞給細胞骨架，細胞骨架上的壓力會進一步觸發(fā)一系列細胞內(nèi)反應(yīng)，從而改變代謝平衡[19]。本實驗通過掃描電鏡及鬼筆環(huán)肽染色細胞肌動蛋白骨架，觀測到了TiO2納米結(jié)構(gòu)陣列產(chǎn)生了類似ECM的作用，促使人牙髓干細胞在接種早期形成絲狀偽足、延伸細胞骨架(圖5B、D)，對細胞早期粘附產(chǎn)生了積極作用，這是骨組織工程希望得到的材料性能[14]。同時，實驗組表面相對不規(guī)則的微觀形態(tài)并未阻滯細胞增殖(圖6A)。細胞內(nèi)ALP在牙本質(zhì)和骨組織成骨礦化的早期出現(xiàn)表達上調(diào)，是干細胞成骨分化的重要指標[10]。成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)條件下，實驗組的表面細胞有更好的成骨分化表現(xiàn)(圖6B)。但是，表面成型TiO2納米管陣列的多孔支架在機體中具體的骨修復(fù)表現(xiàn)處于未知狀態(tài)。

綜上所述，本實驗成功提出了一種表面TiO2納米管陣列的成型策略，突破了異類底層材料的限制，成功結(jié)合了具備優(yōu)異宏觀性能的三維多孔ZrO2支架。從毫米級、微米級、納米級分層設(shè)計并制造出一種潛在滿足骨修復(fù)多層次需求的骨組織工程材料，并且初步驗證了對于干細胞的早期粘附和成骨分化具有促進作用。

注：所有作者聲明不存在利益沖突