許 超 王 娟 劉 鋒 梁潔敏 劉偉偉

顳葉癲癇是成人最常見的藥物難治性癲癇[1～4]，長期發(fā)作會(huì)造成嚴(yán)重腦損害[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞在癲癇發(fā)生過程中有重要作用[6]。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2c（myocyte enhancer factor 2C，MEF2C）被認(rèn)為是調(diào)節(jié)癲癇的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，可調(diào)控多種受體和信號(hào)通路的表達(dá)[7]。研究證實(shí)，miR-203可抑制MEF2C的表達(dá)[8]。本研究通過建立顳葉癲癇大鼠模型，探討miR-203在顳葉癲癇疾病中的作用以及對(duì)MEF2C/NF-κB通路的影響，為深入闡述顳葉癲癇的發(fā)病機(jī)制以及治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性SD大鼠60只，8周齡，體重200～220 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[許可證編號(hào)SCXK（京）2016-0006]。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陰性對(duì)照組、miR-203抑制劑組。

1.2 大鼠癲癇模型的制作 隨機(jī)選擇10只大鼠作為假手術(shù)組，其余50只大鼠采用文獻(xiàn)[9]報(bào)道方法制作癲癇模型。用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，固定于立體定位儀上。以前囟為參考點(diǎn)，分別確定前、后囟在操縱器Z軸上的標(biāo)度。用微量注射器將2.5 μl（0.5 μg/μl）海人酸注入大鼠左側(cè)海馬CA3區(qū)。假手術(shù)組相同部位注入等量的生理鹽水。造模時(shí)14只大鼠死亡，將剩余36只存活大鼠隨機(jī)分為模型組、陰性對(duì)照組和miR-203抑制組，每組12只。

1.3 干預(yù)方法 由上海基因化學(xué)有限公司構(gòu)建一個(gè)攜帶miR-203 inhibitor的腺相關(guān)病毒（adeno-associated viral，AAV），陰性對(duì)照為空AAV載體。AAVmiR-203的滴度為1.0 ×1012，通過微量注射器以0.2 μl/min的速度注入左側(cè)海馬背側(cè)（前額后3.12 mm，中線外側(cè)3.0 mm，前額腹側(cè)3.4 mm）和海馬腹側(cè)（前額后5.04 mm，中線外側(cè)5.0 mm，前額腹側(cè)6.4 mm），每個(gè)位置注射3μl。

1.4 取材 干預(yù)7 d后，3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠后，4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦。取出右側(cè)海馬背側(cè)組織CA3區(qū)域，每組隨機(jī)選擇6只大鼠海馬組織，4℃下在研缽中進(jìn)行組織勻漿，用于提取miRNA和總蛋白；另外6只大鼠組織用4%多聚甲醛固定24 h，用石蠟包埋，制備組織蠟塊。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測海馬組織miR-203水平取海馬CA3區(qū)組織勻漿，用TRIzol試劑（大連寶生生物科技有限公司）提取miRNA并逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR引物擴(kuò)增，循環(huán)條件為95℃10 min，95℃15 s，60℃60 s，共40個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行量化分析。

1.6 ELISA法檢測海馬組織炎癥因子水平 取海馬CA3區(qū)組織勻漿，用ELISA試劑盒（上海碧云天有限公司）檢測白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNFα）TNF-α含量。

1.7 免疫熒光染色法檢測 將蠟塊進(jìn)行冠狀面切片，經(jīng)干燥、洗滌、滲透，5%山羊血清封閉，并與膠質(zhì)纖維性原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP；1:500；英國Abcam公司）和CD11b/c（1:100；英國Abcam公司）共同孵育過夜。免疫標(biāo)記切片用與Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 488結(jié)合的山羊抗鼠二抗清洗和孵化。DAPI復(fù)染核，使用Image J軟件進(jìn)行人工計(jì)數(shù)。

1.8 TUNEL染色 按TUNEL試劑盒（武漢博士德公司）說明進(jìn)行染色。取冠狀面切片脫蠟至水，室溫下用含0.1%Triton X-100的PBS洗滌5 min。組織干燥后，加入50 ml反應(yīng)混合液（酶濃縮液：標(biāo)記溶液=1:9），然后在37℃黑暗的濕箱中孵育1 h，置于熒光顯微鏡下觀察，選取5個(gè)隨機(jī)視野（×100）。凋亡率=凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 取海馬CA3區(qū)組織勻漿，冰上裂解、粉碎、離心，取上清，定量蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%牛血清白蛋白封閉液封閉2 h。分別加入NF-κB p65及MEF2C蛋白抗體（1:500；英國Abcam公司）孵育過夜。用山羊抗小鼠IgG二抗孵育1 h后，顯影，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因分析 用TargetScan數(shù)據(jù)庫（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù)測miR-203的潛在目標(biāo)后，使用overlapPCR法擴(kuò)增得到含有miR-203結(jié)合位點(diǎn)的MEF2C野生型和突變型全長。構(gòu)建pmirGIO-NC及pmirGIO-MEF2C重組載體。用Lipofectamine TM2000將重組報(bào)告載體和miR-203 mimics或miR-NC轉(zhuǎn)染入HEK293T細(xì)胞中培養(yǎng)24 h后，采用DualGlo雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測各組的熒光強(qiáng)度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理；計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬組織miR-203的表達(dá)變化 與假手術(shù)組（1.00 ±0.04 ）相比，模型組（3.45 ±0.27 ）和陰性對(duì)照組（3.53 ±0.08 ）大鼠海馬組織miR-203表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），而模型組和陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對(duì)照組相比，miR-203抑制劑組海馬組織miR-203相對(duì)表達(dá)量（1.60 ±0.03 ）明顯降低（P＜0.05）。

2.2 海馬組織炎癥因子的含量變化 與假手術(shù)組相比，模型組和陰性對(duì)照組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著增加（P＜0.05），而模型組和陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對(duì)照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

2.3 海馬組織星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況 與假手術(shù)組相比，模型組和陰性對(duì)照組GFAP和CD11b/c陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而模型組和陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明海馬區(qū)放射層星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞呈高度活化狀態(tài)。與模型組和陰性對(duì)照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬組織GFAP和CD11b/c陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

2.4 海馬組織神經(jīng)元凋亡情況 與假手術(shù)組相比，模型組和陰性對(duì)照組大鼠海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多（P＜0.05），而模型組和陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對(duì)照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量則明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖1 各組大鼠海馬組織炎癥因子的含量比較

2.5 海馬組織MEF2C/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與假手術(shù)組相比，模型組和陰性對(duì)照組大鼠海馬組織MEF2C蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）、NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；而模型組和陰性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與模型組和陰性對(duì)照組相比，miR-203抑制劑組大鼠海馬組織MEF2C蛋白表達(dá)量顯著升高、NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）。見圖4。

2.6 miR-203靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因分析 與模擬對(duì)照組比較，miR-203 mimics和野生型MEF2C（MEF2C-3'UTR-WT）共轉(zhuǎn)染可明顯抑制熒光素酶活性（P＜0.05），但與突變型MEF2C共轉(zhuǎn)染則對(duì)熒光素酶活性無影響（P＞0.05）。見圖5。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增生是目前已經(jīng)明確的癲癇病理特征之一，會(huì)改變血腦屏障的完整性、離子和神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)興奮過度和癲癇活動(dòng)的產(chǎn)生和擴(kuò)散。微小核糖核酸是調(diào)節(jié)下游編碼基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要介質(zhì)，并且在癲癇的病因和發(fā)展中起關(guān)鍵的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，子癇前期miR-203表達(dá)的增加，會(huì)促進(jìn)炎癥反應(yīng)[10]；沉默miR-203表達(dá)，可以上調(diào)甘氨酸受體-β的表達(dá)，對(duì)慢性癲癇小鼠有一定的治療作用[11]。本研究采用大鼠海馬內(nèi)注射海人酸建立癲癇動(dòng)物模型，使用AAV構(gòu)建AAV-miR-203 inhibitor，并注入左側(cè)海馬區(qū)沉默miR-203的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-203低表達(dá)組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡數(shù)量明顯減少，MEF2C蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯降低，炎癥因子分泌明顯減少。這說明下調(diào)miR-203表達(dá)，可能通過調(diào)節(jié)MEF2C相關(guān)信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制海馬膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)維持神經(jīng)元的生存環(huán)境起著重要的作用。當(dāng)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸或γ氨基丁酸的攝取能力發(fā)生改變時(shí)，可導(dǎo)致癲癇發(fā)作，主要病理改變包括海馬硬化、神經(jīng)元丟失以及腦組織內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞增生[12]。當(dāng)癲癇發(fā)作時(shí)，GFAP表達(dá)明顯增加，同時(shí)伴隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞異?；罨痆13]。與星形膠質(zhì)細(xì)胞有所不同的是，在顳葉癲癇潛伏期時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/c已經(jīng)出現(xiàn)高表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞增殖活性明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬組織星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞都出現(xiàn)異常活化現(xiàn)象，GFAP或CD11b/c陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量明顯增多；抑制miR-203表達(dá)后，GFAP或CD11b/c陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量均明顯減少。除此以外，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡明顯，這也是顳葉癲癇誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的重要機(jī)制之一，而miR-203低表達(dá)組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少。這說明抑制miR-203表達(dá)可減輕癲癇引起的海馬組織神經(jīng)元損傷。

圖2 各組大鼠海馬組織GFAP和CD11b/c免疫熒光染色分析（×400）

圖3 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡情況（×100）

圖4 各組大鼠海馬組織MEF2C、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況

圖5 生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析miR-203和MEF2CmRNA的靶向關(guān)系

另外，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化共同產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子[14]，而炎癥因子的大量分泌，一方面會(huì)進(jìn)一步增加神經(jīng)元的興奮性，提高癲癇的易感性；另一方面，也是引起神經(jīng)元凋亡的重要原因之一[15]。因而，控制炎性因子的釋放也許是顳葉癲癇的治療手段之一。本研究模型組大鼠觀察到的促炎性細(xì)胞因子水平的增加；下調(diào)miR-203表達(dá)，明顯降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平，說明抑制miR-203表達(dá)在控制顳葉癲癇的炎癥反應(yīng)中也起著積極的作用。

MEF2轉(zhuǎn)錄因子家族在許多生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括神經(jīng)發(fā)育、心臟發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等[16]。MEF2C在中樞神經(jīng)元系統(tǒng)中呈高表達(dá)，具有反式激活作用和DNA結(jié)合活性，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的NF-κB表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)[17]。NF-κB與是細(xì)胞中具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的一種蛋白質(zhì)[18]。炎癥因子可激活NF-κB p65，進(jìn)而刺激成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展。何乾超等[19]研究表明NF-κB信號(hào)通路激活與癲癇發(fā)作密切相關(guān)。本研究證實(shí)miR-203對(duì)于MEF2C基因的轉(zhuǎn)錄翻譯有一定的靶向抑制作用，miR-203低表達(dá)組大鼠海馬組織MEF2C蛋白表達(dá)量顯著升高，同時(shí)NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯降低。這說明下調(diào)miR-203對(duì)于MEF2C/NF-κB信號(hào)通路有一定的調(diào)控作用。這可能是下調(diào)miR-203表達(dá)保護(hù)海馬組織膠質(zhì)神經(jīng)元損傷和抑制炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。

綜上所述，miR-203在顳葉癲癇大鼠海馬組織中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-203表達(dá)后，可通過靶向調(diào)節(jié)下游MEF2C/NF-κB信號(hào)通路，抑制顳葉癲癇大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。