陶 祥 張文斐 劉駿輝 朱曉楠 冀保衛(wèi) 張 戈 徐海濤 陳治標(biāo)

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，具有侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點(diǎn)[1～3]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-tomesenchymal transition，EMT）在這一過(guò)程中起關(guān)鍵作用，而Snail homolog 2（SNAI2）和E-cadherin是EMT的關(guān)鍵分子[4]。研究表明多亮氨酸重復(fù)區(qū)免疫球蛋白樣蛋白1（leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1）抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲[5]，但具體機(jī)制尚不清楚。還有研究表明LTIG1抑制EMT，從而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲[6]。本研究探討過(guò)表達(dá)LRIG1對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲、遷移的影響及EMT在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞[中國(guó)科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫(kù)]用含10%胎牛血清（杭州四季青生物材料研究所）的DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）培養(yǎng)。應(yīng)用LipofectamineTM 2000（美國(guó)Invitrogen公司）試劑盒將質(zhì)粒pLRIG1-GFP（pLRIG1-GFP組）及其空載pEGFP-N1質(zhì)粒（pEGFP-N1組；武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科廖建明博士饋贈(zèng)）轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，G418挑選具有抗性的細(xì)胞并擴(kuò)增，以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。另選擇不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒U251細(xì)胞作為空白對(duì)照組。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA，并合成cDNA（42℃、60 min，70℃、5 min）。PCR擴(kuò)增：預(yù)變性95℃持續(xù)1 min；循環(huán)35次95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，20 s；末段延伸72℃持續(xù)5 min；溶解曲線72℃→95℃，每20 s升溫1℃；依據(jù)ΔΔCT法處理結(jié)果。PCR引物（美國(guó)Invitrogen公司）：LRIG1正義鏈5'-CCGGGTGATACAACCTTGCT-3'，反義鏈5'-ACACCGAAGTGGACTGTTACTCC-3'；SNAI2正 義 鏈5'-CCCAGGCTCACATATTCCTTGT-3'，反 義 鏈5'-ACACCGAAGTGGACTGTTA CTCC-3'；E-cadherin正義鏈5'-ATAGTTCGAGGTTCTGGTATGGG-3'，反義鏈5'-ACTGGTGCCATTTCCACTCG-3'；GAPDH正義鏈5'-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3'，反義鏈5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。

1.3 免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 以RIPA裂解液提取總蛋白，標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白含量，常規(guī)SDS-PAGE電泳與轉(zhuǎn)膜。一抗處理4℃孵育過(guò)夜；二抗處理室溫孵育1 h；然后ECL發(fā)光與顯影。所用抗體：兔抗人LRIG1多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司），兔抗人Ecadherin、SNAI2、N-cadheirn和Vimentin多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），鼠抗人LRIG1、SNAI2、GAPDH、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin單克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）。

圖1 pLRIG1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞效果

1.4 細(xì)胞侵襲、遷移實(shí)驗(yàn) 遷移實(shí)驗(yàn)：無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，1×105細(xì)胞加入800μl無(wú)血清培養(yǎng)基于Transwell小室（美國(guó)Corning公司）上層，下室添加含10%胎牛血清的培養(yǎng)基1 m l，培養(yǎng)24 h后，取出小室；用下室培養(yǎng)基充分淋洗下室的底面，無(wú)菌棉簽擦去薄膜上上層的細(xì)胞；結(jié)晶紫染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察，100倍下計(jì)數(shù)10個(gè)視野并取平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)：50 mg/L的Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)R&D Systems公司）4℃融化后，無(wú)血清培養(yǎng)基1:8稀釋；200 μl包被小室半透膜上室面，4℃風(fēng)干備用；其余操作步驟同轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Gr aph Pad Pr i sm 6.0 軟件分析；計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析；用Kaplan-Meier法制作生存曲線；以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果 成功構(gòu)建高表達(dá)LRIG1的膠質(zhì)瘤細(xì)胞pLRIG1-GFP-U251及其對(duì)照組pEGFP-N1-U251，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞散發(fā)綠色熒光，空白對(duì)照組未見(jiàn)熒光（圖1A）。pLRIG1-GFP組LRIG1 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于pEGFP-N1組和空白對(duì)照組（P＜0.05；圖1B、1C），而后兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05；圖1B、1C）。

2.2 上調(diào)LRIG1對(duì)U251細(xì)胞侵襲及遷移的影響pLRIG1-GFP組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于pEGFP-N1組和空白對(duì)照組（P＜0.05；圖2），而后兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05；圖2）。

2.3 上調(diào)LRIG1對(duì)U251細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響pLRIG1-GFP組SNAI2、N-cadherin、vimentin mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于pEGFP-N1組和空白對(duì)照組（P＜0.05；圖3），而E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯高于pEGFP-N1組和空白對(duì)照組（P＜0.05；圖3）；后兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05；圖3）。

圖2 上調(diào)LRIG1對(duì)U251細(xì)胞侵襲及遷移的影響

3 討論

圖3 上調(diào)LRIG1對(duì)U251細(xì)胞EMT標(biāo)記mRNA表達(dá)的影響

圖4 上調(diào)LRIG1對(duì)U251細(xì)胞EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響

LRIG1是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）下游基因的表達(dá)產(chǎn)物，主要參與形成EGFR負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路[7]，負(fù)反饋抑制EGFR通路[8]。LRIG1可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[9]，增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞放療及化療敏感性[10，11]。有研究報(bào)道，下調(diào)LRIG1可激活EGFR/AKT/c-Myc信號(hào)通路，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲[11]。本研究將pLRIG1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到U251細(xì)胞中，結(jié)果顯示U251細(xì)胞LRIG1表達(dá)水平明顯提高，而膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯下降，EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。這提示過(guò)表達(dá)LRIG1，可能通過(guò)抑制EMT過(guò)程，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲和遷移。

E-cadherin是跨膜糖蛋白，參與上皮細(xì)胞間的相互連接，其功能喪失通常與各種腫瘤的不良預(yù)后和生存期縮短有關(guān)[12]。E-cadherin在腫瘤細(xì)胞表面的丟失與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移有關(guān)，不同機(jī)制導(dǎo)致的膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲或遷移能力增強(qiáng)均伴有不同程度的E-cadherin表達(dá)下調(diào)。腫瘤細(xì)胞Ecadherin表達(dá)下調(diào)，伴有N-cadherin及vimentin上調(diào)是腫瘤細(xì)胞EMT的重要標(biāo)志。細(xì)胞內(nèi)E-cadherin向N-cadherin的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲或遷移，從而產(chǎn)生對(duì)治療的抗性。

與LRIG1具有相似結(jié)構(gòu)域的另一種富含亮氨酸重復(fù)序列的跨膜蛋白G蛋白偶聯(lián)受體5，可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)EMT，并與膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后相關(guān)[13]。LRIG1通過(guò)下調(diào)EGFR/PI3K/AKT信號(hào)通路及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和vimentin活性，抑制低氧環(huán)境誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤血管發(fā)生能力[14]，而后者與惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲與遷移相關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，LRIG1可下調(diào)下游SNAI2信號(hào)通路蛋白表達(dá)，下調(diào)E-cadherin表達(dá)，上調(diào)N-cadherin及vimentin表達(dá)。因此，我們猜測(cè)，上調(diào)LRIG1表達(dá)，抑制U251細(xì)胞侵襲及遷移，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞EMT的進(jìn)程有關(guān)。但是，我們的實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究，也未能在多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及動(dòng)物模型中驗(yàn)證，因此上述機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。