喬建新 劉熙鵬 段升強 劉 明 曹 兵

膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，在腦腫瘤中占比超過50%，約82%為膠質(zhì)母細胞瘤，具有侵襲性強、復發(fā)率高的特點，5年生存率僅4.7 %[1]。膠質(zhì)瘤發(fā)生、進展、復發(fā)機制復雜，與多種蛋白、基因改變有關(guān)。研究表明，去泛素化酶與泛素化酶相互作用，對癌基因、抑癌基因具有調(diào)節(jié)作用，參與腫瘤進展[2]。泛素化羧基末端水解酶37（ubiquitin C-terminal hydrolase 37，UCH37）是去泛素化酶的重要組成部分，與多種惡性腫瘤有關(guān)[3～5]。本文探討腦膠質(zhì)瘤組織UCH37表達變化及其與病人預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標本來源 納入標準：年齡≥18歲，病理證實為腦膠質(zhì)瘤；手術(shù)前后病例資料齊全；精神狀態(tài)、認知功能正常，能配合檢查；知曉研究內(nèi)容，并簽署同意書。排除標準：患有其他部位原發(fā)性腫瘤；術(shù)前進行放、化療；既往有顱腦損傷史；患肝、腎、心等臟器疾病。

選取2017年6月至2019年6月手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織104例，其中男55例，女49例；年齡40～73歲，平均（56.49 ±12.15 ）歲；腫瘤直徑1～6 cm，平均（3.23 ±1.21 ）cm；WHO分級Ⅰ級32例，Ⅱ級43例，Ⅲ級29例；星形膠質(zhì)細胞瘤48例，少突膠質(zhì)細胞瘤27例，室管膜瘤18例，其他11例；腫瘤全切除49例，非全切除55例；術(shù)后放療81例；發(fā)生癲癇20例。選取64例瘤旁組織作為對照。

1.2 免疫組化法檢測UCH37蛋白表達水平 組織塊制備成石蠟塊，切片厚度4μm。脫蠟后，3%過氧化氫滅火內(nèi)源性酶，PBS清洗3次。用PBS在高壓下反應3 min、冷卻20 min進行抗原修復。5%胎牛血清封閉10 min，加入一抗4℃下過夜，PBS清洗3次，加入二抗，37℃反應30 min。加入鏈球菌親和素（經(jīng)辣根酶化后）37℃反應30 min，PBS清洗4次。DAB顯色，經(jīng)蘇木素復染后，顯微鏡下觀察。

根據(jù)文獻[6]報道方法判定染色結(jié)果：選擇高倍鏡（×400）4個視野，進行染色計分（無染色、輕微褐色、中度褐色以及深褐色分別計0、1、2、3分）和陽性細胞率計分（陽性細胞≤20%、20%～75%、75%～90%、＞90%分別計0、1、2、3分），兩項評分的乘積即為目的基因表達分值，0～4分低表達，6～9分高表達。

1.3 qRT-PCR檢測UCH37 mRNA表達水平 提取蠟塊方標本總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參考說明書進行擴增，反應條件為95℃3 min，95℃20 s，60℃20s，68℃20s，共30個循環(huán)。PCR擴增引物由賽默飛世爾公司設計：UCH37上游引物為5'-TGTCTCATGGAAAGCGACCC-3'，下 游 為5'-GCCACTTGAAAAGAAAAATTAACCC-3'。以β-actin為內(nèi)參，上游引物為5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3'，下游為5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。通過2-△△Ct值表示UCH37基因相對表達量。

1.4 隨訪 術(shù)后隨訪18個月，記錄生存、死亡情況。1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0 軟件分析；計數(shù)資料行χ2檢驗；計量資料以表示，用t檢驗；采用多因素logistic回歸分析死亡的危險因素；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線；繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析UCH37評估預后的效果；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織UCH37的表達情況 腦膠質(zhì)瘤組織UCH37高表達率（59.62%，62/104）明顯高于瘤旁組 織（17.19 %，11/64；P＜0.05 ）。腦 膠 質(zhì) 瘤 組 織UCH37 mRNA表達量[（2.68 ±0.75 ）]明顯高于瘤旁組織（0.83 ±0.09 ；P＜0.001 ）。

2.2 預后影響因素分析104例中，死亡20例，存活84例。單因素分析顯示，年齡、腫瘤直徑、病理分級、腫瘤切除程度、UCH37表達水平、顱內(nèi)壓增高與術(shù)后死亡有關(guān)（P＜0.05；表1）。多因素logistic回歸分析顯示，年齡≥60歲、腫瘤直徑≥3 cm、病理分級Ⅲ級、腫瘤非全切除、UCH37高表達是腦膠質(zhì)瘤術(shù)后死亡的獨立危險因素（P＜0.05；表2）。

2.3 UCH37表達水平與病人生存期的關(guān)系104例中，UCH37高表達62例，低表達42例。高表達組中位生存期（9個月）較低表達組（13個月）明顯縮短（P＜0.05，圖1）。

2.4 UCH37 mRNA表達量對預后的評估價值ROC曲線分析顯示，UCH37 mRNA評估術(shù)后病人死亡的最佳界值為2.725 ，曲線下面積為0.797 （95%置信區(qū)間0.695 ～0.899 ），敏 感 度 為70.00 %，特 異 度 為70.10%。見圖2。

表1 本文104例膠質(zhì)瘤預后影響因素的單因素分析（例）

表2 本文104例膠質(zhì)瘤預后影響因素的單因素Cox比例回歸風險模型分析

圖1 膠質(zhì)瘤組織UCH37表達水平與病人預后關(guān)系的生存曲線分析

圖2 膠質(zhì)瘤組織UCH37 mRNA水平評估病人術(shù)后死亡的ROC曲線

3 討論

目前，膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚未徹底明確，但與家族遺傳、離子輻射等有關(guān)，而腫瘤侵襲機制主要與機體免疫力、腫瘤微環(huán)境等有關(guān)[7]。腦膠質(zhì)瘤的手術(shù)切除具有一定的難度，部分病人還會出現(xiàn)化療耐藥、放療抵抗等情況，導致腫瘤復發(fā)風險增高，預后欠佳[8]。明確腦膠質(zhì)瘤進展機制，可為膠質(zhì)瘤的治療提供指導。近年來，臨床研究認為，UCH37參與腫瘤進展。王麗娟等[9]發(fā)現(xiàn)，UCH37在惡性黑素瘤組織中呈高表達，其高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期密切相關(guān)。劉華柱和鄧明明[10]研究提示，結(jié)腸癌組織UCH37為高表達，對腫瘤細胞增殖有促進作用。本文結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織UCH37呈高表達。UCH37是泛素羧基末端水解酶家族的一員，能夠?qū)Φ鞍走h端的多聚亞基進行拆分，使蛋白質(zhì)降解受到抑制。研究表明，UCH37能通過阻止泛素化調(diào)節(jié)因子2與Smad7相結(jié)合，抑制二者復合物形成，使Ⅰ型轉(zhuǎn)化生長因子-β（transfor ming growth factor-β，TGF-β）受體免于泛素化，導致TGF-β表達上調(diào)[11]。李欽濤等[12]研究顯示，惡性膠質(zhì)瘤組織TGF-β表達水平較瘤旁組織明顯增高。另有學者發(fā)現(xiàn)，正常腦組織無TGFβ表達或表達量極低，而腦膠質(zhì)瘤可見TGF-β過表達，PI3K、Smad等信號通路發(fā)生變異后，能誘導TGF-β促進腫瘤細胞分化、增殖，增強膠質(zhì)瘤的侵襲性與惡變程度[13]。這提示膠質(zhì)瘤UCH37過表達，可能通過上調(diào)TGF-β表達，促進膠質(zhì)瘤發(fā)生、進展。

UCH37對腦膠質(zhì)瘤預后有較大影響。本文結(jié)果顯示，UCH37高表達是腦膠質(zhì)瘤病人術(shù)后死亡的獨立危險因素，而且UCH37高表達病人生存期明顯縮短，膠質(zhì)瘤組織UCH37 mRNA水平對預后評估效果較好。這表明UCH37與腦膠質(zhì)瘤預后有關(guān)。UCH37促進腫瘤細胞增殖的機制可能與其底物相結(jié)合有關(guān)，促使泛素分子水解，與之結(jié)合的底物包括轉(zhuǎn)錄因子、酶等，部分底物是抑癌基因或癌基因產(chǎn)物，一旦UCH37與癌基因底物結(jié)合，則能促進腫瘤細胞增殖，抑制腫瘤細胞凋亡，導致病情進一步惡化，增加死亡風險[14]。研究表明，UCH37可以對Tcf7DNA結(jié)合通路進行調(diào)控，使Wnt信號通路活化，發(fā)揮促腫瘤進展作用[15]。這表明UCH37高表達能加速腫瘤惡化，這對病人預后不利。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤組織UCH37呈高表達，是影響術(shù)后病人死亡的獨立危險因素，臨床可通過測定UCH37水平對預后進行預測。