王雨 褚夢(mèng)真 李文靜 林志健 張冰

摘要 目的：從“腸-腎”途徑探討健脾祛濕中藥防治痛風(fēng)病作用。方法：10%果糖塑造大鼠高血尿酸模型，高鈣高嘌呤食餌并限水誘導(dǎo)鵪鶉尿酸鹽沉積模型，以菊苣、參苓白術(shù)散為示例藥。生化檢測(cè)大鼠血清尿酸（SUA）、糞便尿酸（FUA）水平，計(jì)算腎臟尿酸清除率（RCUA）;檢測(cè)鵪鶉糞尿中尿酸含量，計(jì)算尿酸排泄量。免疫組化分析大鼠腸道ABCG2、腎臟URAT1、OAT1，及鵪鶉腸道Occludin、腎臟p-p65表達(dá)。六胺銀染色分析尿酸鹽沉積。結(jié)果：1）菊苣可顯著降低模型大鼠SUA、增加FUA、RCUA，促進(jìn)腸道ABCG2表達(dá)，減少腎臟URAT1表達(dá)。2）參苓白術(shù)散可顯著減少模型鵪鶉腎臟尿酸鹽沉積，增加尿酸排泄量，增加腸道Occludin表達(dá)，減少腎臟p-p65表達(dá)。結(jié)論：痛風(fēng)病發(fā)生發(fā)展中存在“腸-腎”途徑的病理改變，健脾祛濕中藥通過(guò)調(diào)節(jié)“腸-腎”尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)促尿酸排泄、改善腸道屏障功能及腎臟炎癥狀態(tài)以祛除尿酸鹽沉積，共同發(fā)揮防治痛風(fēng)病作用。

關(guān)鍵詞 “腸-腎”途徑;健脾祛濕中藥;痛風(fēng)病;高血尿酸;尿酸鹽沉積

Study on Anti-gout Disease of Traditional Chinese Medicines for Invigorating Spleen and Removing Dampness Based on Intestine and Kidney Axis

WANG Yu，CHU Mengzhen，LI Wenjing，LIN Zhijian，ZHANG Bing

（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China）

Abstract Objective：From the “intestine-kidney” axis to explore the anti-gout disease effect of traditional Chinese medicine for invigorating spleen and removing dampness.Methods：10% fructose created a rat model of high blood uric acid，a high-calcium，high-purine diet and water restriction induced quail urate deposition model，with Cichorium intybus L.and Shenlingbaizhu Powder as example drugs.Biochemical detection of rat serum uric acid（SUA）and fecal uric acid（FUA）levels were detected.The renal uric acid clearance（RCUA）was calculated; uric acid content in quail feces and urine were detected; uric acid excretion was calculated.Rat intestine ABCG2，kidney URAT1，OAT1，quail intestine Occludin，and kidney p-p65 expression were analyzed by Immunohistochemistry.Hexamine silver staining was used to analyze urate deposition.Results：1）Cichorium intybus L.could significantly reduce SUA level，increase FUA and RCUA levels of model rats，increase expression of intestinal ABCG2 and decrease expression of renal URAT1.2）Shenling Baizhu Powder could significantly reduce the renal urate deposition in quails，increase the excretion of uric acid，as well as raise expressions of intestinal Occludin and decrease expressions of renal p-p65.Conclusion：There are some pathological changes of ‘intestine-kidney axis in the development of gout disease.Traditional Chinese medicine for invigorating spleen and removing dampness could prevent and treat the gout disease by adjusting the urate transporters in the intestine and kidney to promote excretion of uric acid，and improving the intestinal barriers and renal inflammatory state to remove the urate deposition.

Keywords Intestine and kidney axis; Traditional Chinese medicine for invigorating spleen and removing dampness; Gout disease; Hyperuricemia; Urate deposition

中圖分類號(hào)：R242;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.003

痛風(fēng)病是指與高尿酸血癥、尿酸鹽沉積密切相關(guān)的進(jìn)展性代謝性疾病，2020年《高尿酸血癥/痛風(fēng)患者實(shí)踐指南》根據(jù)臨床疾病狀態(tài)，將痛風(fēng)病理進(jìn)展分為了3個(gè)階段、8個(gè)狀態(tài)[1]，其中高血尿酸是痛風(fēng)病發(fā)生的重要生化基礎(chǔ)，尿酸鹽沉積是誘發(fā)痛風(fēng)病急性炎性反應(yīng)的重要因素。由此提示，降低高血尿酸、減少尿酸鹽沉積將有助于抑制痛風(fēng)病的發(fā)生發(fā)展。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為尿酸代謝異常引起的高血尿酸及其沉積屬于“濕邪”“濁滯”范疇，臨床常切入脾胃腸腎等器官以健脾化濕泄?jié)?，取得了較好的療效[2]，本組前期也發(fā)現(xiàn)健脾祛濕藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)性高血尿酸亦有顯著的降低作用[3-4]?，F(xiàn)代研究顯示，腸道與腎臟是參與尿酸排泄的關(guān)鍵器官，主要通過(guò)組織中分布的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)了機(jī)體99%的尿酸外排[5]。同時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)在痛風(fēng)病的進(jìn)展過(guò)程中均伴隨著腸道及腎臟的病理變化[6-7]，提示“腸-腎”可能是降低高血尿酸、減少尿酸鹽沉積的重要靶器官。因此，本研究擬分別從痛風(fēng)病高血尿酸階段、尿酸鹽沉積階段著手，切入“腸-腎”途徑，以中藥菊苣及方藥參苓白術(shù)散為示例藥物，開展健脾祛濕中藥抗痛風(fēng)病的系統(tǒng)觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量（240±10）g，購(gòu)于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（京）2011-0004。迪法克鵪鶉30只，雄性，體質(zhì)量（150±10）g，購(gòu)于北京市種禽公司德嶺鵪鶉廠，動(dòng)物檢疫合格證明號(hào)為1100375960。均于室溫（23±1）℃，濕度（45±5）%，12 h光照條件下飼養(yǎng)5 d后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：BUCM-4-2019090302-3033。

1.1.2 藥物

菊苣藥材購(gòu)于新疆市場(chǎng)，由本課題組分別以10倍、8倍水各回流提取1 h后收集濾液、濃縮，獲得菊苣提取物。苯溴馬隆片（德國(guó)赫曼大藥廠，批號(hào)：1208106）。參苓白術(shù)散（山西華康藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：Z14020346）。

1.1.3 試劑與儀器

果糖（AMRESCO公司，美國(guó)，批號(hào)：3573C350）;酵母粉（Oxoid公司，英國(guó)，批號(hào)：1424987）;骨粉（衡水愛寵商貿(mào)有限公司，批號(hào)：20180715）;尿酸檢測(cè)試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：151221）;ABCG2 Polyclonal Antibody（Santa Cruz公司，美國(guó)，批號(hào)：13041）;URAT1 Polyclonal Antibody（ABBIOTEC公司，美國(guó)，批號(hào)：250521）;OAT1 Polyclonal Antibody，Occludin Polyclonal Antibody，p-p65 Polyclonal Antibody（ABCAM公司，英國(guó)，批號(hào)：ab131087，ab168986，ab86299）;兔超敏二步免疫組化檢測(cè)試劑，DAB顯色試劑盒，山羊血清（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：K162714G，16175A01，WK153622）;尿酸鹽染色試劑盒（六胺銀染色法，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20180604）。

酶標(biāo)儀（Teacan公司，瑞士，型號(hào)：Sunrise型）;低溫高速離心機(jī)（Sigma公司，德國(guó)，型號(hào)：3K15型）;恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：HH-600型）;電子天平（島津公司，日本，型號(hào)：B1-220H）;石蠟組織切片機(jī)（AO公司，美國(guó)，型號(hào)：820型）;Olmpus顯微鏡，CCD相機(jī)（奧林巴斯公司，日本，型號(hào)：BX53型，DP72型）;生化培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠，型號(hào)：SPX型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開展健脾祛濕示例中藥菊苣降尿酸的作用研究，采用10%高果糖飲水塑造高尿酸血癥大鼠模型[8]。以鵪鶉為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開展健脾祛濕示例方藥參苓白術(shù)散祛尿酸鹽沉積的作用研究，在本實(shí)驗(yàn)室前期基礎(chǔ)上[9]，以常規(guī)飼料：酵母粉：骨粉=5∶2∶3制備造模食餌，結(jié)合控制日飲水量為15 mL/（只·d），連續(xù)40 d，誘導(dǎo)尿酸鹽沉積鵪鶉模型。

1.2.2 給藥方法

動(dòng)物分組與給藥如下：

根據(jù)體質(zhì)量將SD大鼠隨機(jī)分為正常組，高血尿酸模型組，苯溴馬隆組，菊苣提取物大、小劑量組，每組10只。以預(yù)防性方式進(jìn)行給藥，正常組、高血尿酸模型組大鼠每日給予清水灌胃，苯溴馬隆組給予20 mg/kg苯溴馬隆，菊苣提取物大、小劑量組分別給予相應(yīng)劑量的菊苣提取物灌胃（分別相當(dāng)于生藥量10 g/kg、7.5 g/kg）。

根據(jù)體質(zhì)量將迪法克鵪鶉隨機(jī)分為正常組、尿酸鹽沉積模型組、參苓白術(shù)散組，每組10只。以治療性方式進(jìn)行給藥，正常組、尿酸鹽沉積模型組鵪鶉每日給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，參苓白術(shù)散組給予含2.1 g/kg參苓白術(shù)散的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）生化指標(biāo)檢測(cè)：分別于實(shí)驗(yàn)第20、40天對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行尾尖取血，取血前12 h禁食不禁水，以3 000 r/min離心10 min，離心半徑8 cm，分離血清，根據(jù)尿酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清尿酸水平（Serum Uric Acid，SUA）。取血前接取大鼠糞便，根據(jù)文獻(xiàn)進(jìn)行前處理[10-11]，加入適當(dāng)體積PBS混勻糞便，以4 000 r/min，離心10 min，離心半徑13.5 cm，取上清，加入1/4體積的含碳酸鋰的PBS，超聲混勻后分別于100 ℃、37 ℃孵育30 min、2 h，以10 000 r/min在4 ℃條件下離心10 min，離心半徑8 cm，取上清，生化檢測(cè)糞便中尿酸水平，并根據(jù)公式（a）計(jì)算糞便尿酸含量（Fecal Uric Acid，F(xiàn)UA）。取血后采用代謝籠法收集24 h尿液，以4 000 r/min，離心半徑8 cm，在4 ℃條件下離心10 min取上清，生化檢測(cè)尿液中尿酸水平，根據(jù)公式（b）計(jì)算腎臟尿酸清除率（Renal Clearance Rate of Uric Acid，RCUA）。模擬大鼠代謝籠法收集尿液，對(duì)實(shí)驗(yàn)鵪鶉的6 h糞尿混合物進(jìn)行收集，加入適量PBS混勻后，以4 000 r/min，離心10 min，離心半徑13.5 cm，取上清，生化檢測(cè)糞尿混合物中尿酸水平，并以血清尿酸水平進(jìn)行校正，根據(jù)公式（c）計(jì)算尿酸清除量。

糞便尿酸含量（FUA，μmol/g）=尿酸水平×（PBS稀釋倍數(shù)/糞便重量）×1.25。（a）

腎臟尿酸清除率（RCUA，mL/min）=尿液尿酸/血清尿酸×每分鐘尿量。（b）

尿酸清除量=糞尿尿酸/血清尿酸。（c）

2）免疫組化染色與圖片分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（大鼠、鵪鶉），取小腸組織及腎臟組織，置于4%多聚甲醛溶液固定，用于制備組織石蠟切片。將組織石蠟切片于60 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟復(fù)水，依次以0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液熱修復(fù)30 min，3%H2O2避光孵育15 min，山羊血清封閉孵育10 min后滴加一抗（ABCG2：1∶200;URAT1：1∶100;OAT1：1∶1 000;Occludin：1∶1 000;p-p65：1∶1 000），置于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。而后依次置于37 ℃復(fù)溫孵育1 h，滴加聚合物輔助劑37 ℃濕溫孵育1 h，滴加辣根酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物37 ℃濕溫孵育1 h，DAB顯色至染上棕色顆粒后終止，每步操作間均以PBS清洗3次×5 min。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

以O(shè)lmpus顯微鏡圖像采集系統(tǒng)對(duì)每個(gè)組織3個(gè)不重疊的視野進(jìn)行拍攝，Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果分析，以陽(yáng)性顆粒積分光密度IOD（Inergral Optical density）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3）六胺銀染色與與圖片分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死實(shí)驗(yàn)鵪鶉，取腎臟組織置于無(wú)水乙醇固定，用于制備組織石蠟切片，采用六胺銀特殊染色法對(duì)組織切片中的尿酸鹽沉積進(jìn)行染色。將組織切片依次用二甲苯、無(wú)水乙醇脫蠟后，浸入62 ℃預(yù)熱的六胺銀溶液中，以62 ℃恒溫避光孵育50 min，純水沖洗懸浮黑色物質(zhì)，依次入氯化金溶液、海波溶液浸泡2 min、5 min，純水沖洗后以伊紅淡染，無(wú)水乙醇脫水2次×5 min，二甲苯透明2次×10 min，中性樹膠封片。

以O(shè)lmpus顯微鏡圖像采集系統(tǒng)對(duì)每個(gè)組織3個(gè)不重疊的視野進(jìn)行拍攝，Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行尿酸鹽染色結(jié)果分析，以陽(yáng)性面積Area進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較根據(jù)各組正態(tài)及方差齊與否選擇單因素方差分析或是Kruskal-Wallis軼和檢驗(yàn)，組間兩兩比較根據(jù)方差齊與否選擇采用Dunnett-t檢驗(yàn)或Dunnett′s T3檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健脾祛濕示例中藥調(diào)控“腸-腎”途徑降尿酸作用觀察

2.1.1 菊苣提取物對(duì)血清尿酸水平的影響

與正常組比較，實(shí)驗(yàn)第20、40天，高血尿酸模型組大鼠的SUA水平均顯著升高（P<0.01）。與高血尿酸模型組比較，實(shí)驗(yàn)第20、40天，菊苣提取物大、小劑量組大鼠及本溴馬隆組大鼠的SUA水平均顯著降低（P<0.01或P<0.05）。見表1。

2.1.2 菊苣提取物對(duì)“腸-腎”尿酸排泄水平的影響? 與正常組比較，高血尿酸模型組大鼠的FUA、RCUA水平均顯著降低（P<0.01或P<0.05）。與高血尿酸模型組比較，菊苣提取物大劑量組大鼠的FUA、RCUA水平均顯著升高（P<0.05）;菊苣提取物小劑量組大鼠的FUA水平顯著升高（P<0.05），RCUA水平有升高趨勢(shì)（P=0.07）;苯溴馬隆組大鼠的FUA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RCUA水平有升高趨勢(shì)（P<0.05）。見表2。

2.1.3 菊苣提取物對(duì)“腸-腎”尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響

“腸-腎”尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的免疫組化染色結(jié)果如圖1所示，半定量分析結(jié)果顯示：與正常組比較，高血尿酸模型組大鼠的腸道ABCG2表達(dá)顯著減少（P<0.01），腎臟URAT1表達(dá)顯著增加（P<0.01），腎臟OAT1表達(dá)有增加趨勢(shì)（P=0.059）。與高血尿酸模型組比較，菊苣提取物大、小劑量組大鼠的腸道ABCG2表達(dá)顯著增加（P<0.01）、腎臟URAT1表達(dá)均顯著減少（P<0.01或P<0.05）、腎臟OAT1表達(dá)均有增加趨勢(shì)（P=0.059或P=0.056）;苯溴馬隆組大鼠的腸道ABCG2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腎臟URAT1表達(dá)顯著減少（P<0.01），腎臟OAT1表達(dá)顯著增加（P<0.01）。見表3。

2.2 健脾祛濕示例方藥調(diào)控“腸-腎”途徑祛尿酸鹽沉積作用觀察

2.2.1 參苓白術(shù)散對(duì)尿酸鹽沉積水平的影響

尿酸鹽沉積的六胺銀染色結(jié)果如圖2所示，正常組鵪鶉腎臟中未見明顯的黑色尿酸鹽沉積，尿酸鹽沉積模型組及參苓白術(shù)散組鵪鶉腎臟中可見明顯的黑色尿酸鹽沉積。半定量分析結(jié)果顯示，與尿酸鹽沉積模型組比較，參苓白術(shù)散組鵪鶉腎臟中尿酸鹽沉積水平顯著減少（P<0.01）。見表4。

2.2.2 參苓白術(shù)散對(duì)“腸-腎”尿酸清除量的影響

與正常組比較，尿酸鹽沉積模型組鵪鶉的腸-腎尿酸清除率顯著降低（P<0.01）。與尿酸鹽沉積模型組比較，參苓白術(shù)散組鵪鶉的腸-腎尿酸清除率有升高趨勢(shì)（P=0.064）。見表5。

2.2.3 參苓白術(shù)散對(duì)腸道屏障功能及腎臟炎性反應(yīng)的影響

腸道屏障緊密結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白Occludin及腎臟炎性反應(yīng)關(guān)鍵蛋白p-p65的免疫組化染色結(jié)果如圖3所示，半定量分析結(jié)果顯示：與正常組比較，尿酸鹽沉積模型組鵪鶉的腸道Occludin表達(dá)顯著減少（P<0.01），腎臟p-p65表達(dá)顯著增加（P<0.01）。與尿酸鹽沉積模型組比較，參苓白術(shù)散組鵪鶉腸道Occludin表達(dá)顯著增加（P<0.05），腎臟p-p65表達(dá)顯著減少（P<0.01）。見表6。

3 討論

3.1 “腸-腎”途徑在痛風(fēng)病疾病進(jìn)展中的作用

痛風(fēng)病是指與高尿酸血癥、尿酸鹽沉積密切相關(guān)的進(jìn)展性代謝性疾病。2020年《高尿酸血癥/痛風(fēng)患者實(shí)踐指南》突破對(duì)關(guān)節(jié)痛風(fēng)的局限認(rèn)識(shí)，提出高血尿酸和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是同一疾病的不同狀態(tài)，并進(jìn)一步根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其分為了臨床前階段、臨床階段及病程階段，3個(gè)階段依次包括了無(wú)癥狀高尿酸血癥、無(wú)癥狀尿酸鹽沉積、無(wú)癥狀高尿酸血癥伴尿酸鹽沉積、痛風(fēng)、痛風(fēng)石性痛風(fēng)、侵蝕性痛風(fēng)、初次痛風(fēng)發(fā)作、復(fù)發(fā)型痛風(fēng)發(fā)作8個(gè)狀態(tài)，且上述不同疾病狀態(tài)可同時(shí)出現(xiàn)[1]，充分體現(xiàn)了痛風(fēng)病的進(jìn)展性、反復(fù)性的臨床特點(diǎn)。其中，高血尿酸及尿酸鹽沉積貫穿了痛風(fēng)病發(fā)生發(fā)展發(fā)作的始終，且二者在疾病進(jìn)程中存在相互轉(zhuǎn)化、促進(jìn)，血尿酸的持續(xù)升高可促進(jìn)尿酸鹽飽和析出，尿酸鹽結(jié)晶的聚集沉積可誘發(fā)組織損傷，使得血尿酸水平進(jìn)一步升高。由此可見，高血尿酸及尿酸鹽沉積的共性病理環(huán)節(jié)探討將是痛風(fēng)病防治的重要方向。

機(jī)體內(nèi)的尿酸穩(wěn)態(tài)取決于尿酸生成與排泄的動(dòng)態(tài)平衡，尿酸生成增多和/或排泄減少均會(huì)引起血尿酸水平的異常升高。流行病學(xué)研究顯示，90%的原發(fā)性血尿酸水平的升高與尿酸排泄障礙密切相關(guān)[11]。腸道與腎臟是尿酸排泄的主要器官，其中腎臟尿酸排泄量占機(jī)體尿酸排泄總量的66%，腸道尿酸排泄量占機(jī)體尿酸排泄總量的33%[12]。本研究在10%高果糖誘導(dǎo)的大鼠高血尿酸模型中觀察到了糞便尿酸含量、腎臟尿酸清除率的顯著降低，這與本組前期結(jié)果趨勢(shì)一致[13-14]，再次明確了“腸-腎”排泄途徑對(duì)維持機(jī)體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵作用?！澳c-腎”尿酸的外排功能主要依賴于尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)實(shí)現(xiàn)，主要包括介導(dǎo)腸道尿酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)的腺苷三磷酸結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCG2（ATP-binding Cassette of Half-transporter Protein），介導(dǎo)腎臟尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體9（Glucose Transporter 9，Glut9）、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Urate Anion Transporter，1URAT1）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體4（Organic Anion Transporter，4OAT4），介導(dǎo)腎臟尿酸分泌的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族成員1（Organic Anion Transporter 1，OAT1）、成員3（Organic Anion Transporter 3，OAT3）、尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（Urate Transporter，UAT）[15]。本研究分別選取“腸-腎”尿酸排泄途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)高果糖誘導(dǎo)的高血尿酸大鼠腸、腎尿酸排泄的異常進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，高血尿酸模型組大鼠的腸道ABCG2蛋白表達(dá)顯著降低，腎臟URAT1蛋白表達(dá)顯著增加，腎臟OAT1蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，這與現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)具有一致性，同時(shí)提示高果糖誘導(dǎo)的高血尿酸大鼠模型可為作用于“腸-腎”途徑的降尿酸藥物研究提供動(dòng)物模型載體。

尿酸鹽沉積是血尿酸過(guò)飽和析出的直接結(jié)果，亦是誘發(fā)痛風(fēng)病急性炎性反應(yīng)的必要因素。由于關(guān)節(jié)痛風(fēng)紅腫熱痛的顯著臨床表現(xiàn)，尿酸鹽在關(guān)節(jié)腔及其周圍組織的沉積受到學(xué)者的廣泛研究，而對(duì)于其在腎臟組織中的沉積往往是進(jìn)展到痛風(fēng)石形成后才受到關(guān)注，這可能與內(nèi)臟組織痛覺(jué)神經(jīng)不敏感，以及尿酸鹽內(nèi)臟沉積臨床診療手段不足有關(guān)。目前尿酸鹽沉積研究亦受到動(dòng)物模型的局限，由于常用于實(shí)驗(yàn)研究的嚙齒類動(dòng)物存在可迅速分解尿酸的尿酸酶，與人類尿酸代謝途徑存在較大差異，其尿酸水平的升高往往難以實(shí)現(xiàn)內(nèi)源性尿酸鹽沉積。鑒于此，本研究選取與人類尿酸代謝途徑相似的禽類動(dòng)物鵪鶉，在前期高嘌呤飲食誘導(dǎo)高尿酸血癥鵪鶉模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合高鈣及限水飲食進(jìn)一步促進(jìn)血尿酸水平的升高，觀察到了尿酸鹽在鵪鶉腎臟組織中的首要沉積。結(jié)合尿酸鹽的致炎作用[16]，本研究對(duì)痛風(fēng)病相關(guān)的NF-κB炎癥信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白即p65的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)，免疫組化染色結(jié)果顯示，尿酸鹽沉積模型組鵪鶉的腎臟組織中p-p65蛋白表達(dá)顯著增加。此外，我們亦對(duì)腸道組織中尿酸鹽沉積進(jìn)行了考察，然而并未發(fā)現(xiàn)尿酸鹽的沉積，這可能與腸道管腔性結(jié)構(gòu)及腸道菌群對(duì)尿酸的分解作用有關(guān)[17]，但顯著觀察到了腸道組織中Occludin蛋白表達(dá)的降低。Occludin蛋白是組成腸道屏障緊密連接結(jié)構(gòu)的代表性咬合蛋白之一，腸道屏障緊密連接結(jié)構(gòu)的完整是實(shí)現(xiàn)腸道正常生理功能的重要基礎(chǔ)，其結(jié)構(gòu)的異常會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞通透性的增加，使得細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子有害物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，誘發(fā)疾病[18]。有研究發(fā)現(xiàn)高血尿酸狀態(tài)下，腸道菌群及腸道機(jī)械屏障發(fā)生病理改變，革蘭氏陰性菌細(xì)的代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素入血增加[19]，而內(nèi)毒素水平的升高正是腎臟損傷的重要誘導(dǎo)因素[20]。由此提示，痛風(fēng)病尿酸鹽沉積階段存在獨(dú)立于血尿酸之外的“腸-腎”途徑病理改變，這可能與腸道通透性增加，腸源性毒素入血增加，干擾腎臟生理功能，誘導(dǎo)組織炎性反應(yīng)有關(guān)，其具體機(jī)制有待于深入研究。

3.2 健脾祛濕中藥干預(yù)“腸-腎”途徑防治痛風(fēng)病作用

中醫(yī)認(rèn)為血尿酸的升高及其沉積多由飲食不節(jié)，過(guò)食肥甘，阻礙脾運(yùn)化功能，釀生濕濁痰飲而致[21]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)腸道的功能認(rèn)識(shí)，與中醫(yī)理論中“脾”的功能類似，并且腸道不僅有消化、吸收功能，還具排泄功能，這與中醫(yī)理論中的小腸“泌別清濁”、大腸“主津”理論相一致。同時(shí)，腎主調(diào)節(jié)一身水液之代謝，脾主運(yùn)化功能又有賴于腎陽(yáng)的溫煦和氣化，腎不主水亦是濕濁為患的重要因素。因此，本研究結(jié)合健脾祛濕藥物在臨床及實(shí)驗(yàn)中降尿酸的優(yōu)勢(shì)作用，切入“腸-腎”途徑，分別以健脾祛濕藥菊苣、參苓白術(shù)散為示例藥物，對(duì)其降尿酸、祛沉積的防治痛風(fēng)病作用進(jìn)行系統(tǒng)觀察。

菊苣是菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根，功效清肝利膽、健胃消食、利尿消腫，歸肝、膽、胃經(jīng)。以菊苣提取物干預(yù)高血尿酸大鼠模型，結(jié)果顯示，菊苣提取物可顯著降低模型大鼠的血尿酸水平，并增加其糞便尿酸含量及促進(jìn)腎臟尿酸清除，提示菊苣提取物對(duì)腸、腎尿酸排泄均有促進(jìn)作用。同時(shí)，本研究亦觀察到菊苣提取物可顯著增加腸道ABCG2表達(dá)，減少腎臟URAT1表達(dá)，對(duì)腎臟OAT1亦有增加趨勢(shì)，結(jié)合上述蛋白的生理功能，提示菊苣提取物可通過(guò)調(diào)控“腸-腎”尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn)“腸-腎”尿酸排泄，發(fā)揮降尿酸作用。參苓白術(shù)散首載于《太平惠民和劑局方》[22]，由人參、茯苓、白術(shù)、白扁豆等10味中藥組成，具健脾益氣、滲濕止瀉之效用。以參苓白術(shù)散干預(yù)尿酸鹽沉積鵪鶉模型，結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散可顯著減少模型鵪鶉腎臟組織中的尿酸鹽沉積，對(duì)糞尿尿酸排泄量的增加亦有促進(jìn)趨勢(shì)。同時(shí)，本研究亦觀察到參苓白術(shù)散可顯著增加腸道Occludin表達(dá)，并減少腎臟組織中p-p65表達(dá)，結(jié)合腸、腎組織在痛風(fēng)病進(jìn)展中的重要作用，提示參苓白術(shù)散可通過(guò)改善腸道屏障，減少有害物質(zhì)進(jìn)入血循環(huán)，并抑制腎臟炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮祛除尿酸鹽沉積的作用。

綜上所述，本研究分別從痛風(fēng)病高血尿酸階段、痛風(fēng)病尿酸鹽沉積階段著手，明確了在痛風(fēng)病發(fā)生發(fā)展中存在“腸-腎”途徑的病理改變，并進(jìn)一步以健脾祛濕示例藥物進(jìn)行干預(yù)，切入“腸-腎”途徑，明確了健脾祛濕中藥通過(guò)調(diào)節(jié)“腸-腎”尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)促尿酸排泄、改善腸道屏障功能及腎臟炎癥狀態(tài)祛除尿酸鹽沉積，從而實(shí)現(xiàn)防治痛風(fēng)病的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]黃葉飛，楊克虎，陳澍洪，等.高尿酸血癥/痛風(fēng)患者實(shí)踐指南[J].中華內(nèi)科雜志，2020，59（7）：519-527.

[2]李秀峰，董霞，魏淑鳳.健脾化濕、泄?jié)峄钛ㄖ委熎⑻摑褡栊透吣蛩嵫Y的臨床療效觀察[J].中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2018，46（12）：1505-1507.

[3]王雨，林志健，張冰.中藥菊苣改善氧化應(yīng)激性炎癥介導(dǎo)的“腸-腎”尿酸排泄研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2020，35（5）：2552-2557.

[4]朱春勝，張冰，林志健，等.菊苣降尿酸藥效驗(yàn)證[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（11）：4933-4936.

[5]Brenner BM，Rector FC.Brenner & Rector′s the kidney[M].10th Edition.Saunders：Elsevier，2004：360-362.

[6]王雨，林志健，邊猛，等.維藥菊苣提取物對(duì)高尿酸血癥狀態(tài)下腸道屏障的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（5）：1718-1723.

[7]閔柳暢，安夢(mèng)麗，何平.高尿酸血癥與各種腎臟疾病關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床研究，2018，31（11）：1589-1591.

[8]李麗玉，林志健，張冰，等.連續(xù)高果糖飲水對(duì)大鼠尿酸水平的影響及其病理機(jī)制[J].中華臨床營(yíng)養(yǎng)雜志，2014，22（6）：368-374.

[9]王海鴿，林志健，張冰，等.高蛋白高鈣飲食合并限制飲水建立鵪鶉痛風(fēng)模型初探[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2019，29（4）：15-22.

[10]王玲，李群.冠心病患者腸道菌群分布及其與尿酸代謝的關(guān)系分析[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2012，17（6）：327-330.

[11]Dincer HE，Dincer AP，Levinson DJ.Asymptomatic hyperuricemia：to treat or not to treat[J].Cleve Clin J Med，2002，69（8）：594-597.

[12]何青，劉德平.高尿酸血癥[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2016：90.

[13]王雨，林志健，聶安政，等.Glut9在果糖誘導(dǎo)大鼠高尿酸血癥中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志，2016，32（12）：2287-2290.

[14]王雨，林志健，張冰.高尿酸血癥大鼠的腸道尿酸排泄研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（2）：110-117.

[15]Yano H，Tamura Y，Kobayashi K，et al.Uric acid transporter ABCG2 is increased in the intestine of the 5/6 nephrectomy rat model of chronic kidney disease[J].Clin Exp Nephrol，2014，18（1）：50-55.

[16]Shi Y，Mucsi AD，Ng G.Monosodium urate crystals in inflammation and immunity[J].Immunol Rev，2010，233（1）：203-217.

[17]周蓓蓓，魏華.高尿酸血癥與腸道菌群的相關(guān)性[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2020，14（1）：76-80.

[18]Turner JR.Intestinal mucosal barrier function in health and disease[J].Nat Rev Immunol，2009，9（11）：799-809.

[19]黃勝男，林志健，張冰，等.腸道菌群結(jié)構(gòu)變化與高尿酸血癥發(fā)生的關(guān)系[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，38（7）：452-456.

[20]王小琪，李忠心.腸道微生物菌群與慢性腎臟病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)血液凈化，2019，18（9）：646-649.

[21]趙智強(qiáng).略論痛風(fēng)、高尿酸血癥的中醫(yī)病因病機(jī)與治療[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37（5）：46-47.

[22]北京中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病專業(yè)委員會(huì)，張聲生，周強(qiáng).參苓白術(shù)散和補(bǔ)中益氣方臨床應(yīng)用專家共識(shí)意見[J].北京中醫(yī)藥，2018，37（7）：590-597.

（2020-12-10收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81673618）;北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（7162117）

作者簡(jiǎn)介：王雨（1991.06—），女，博士，研究方向：中藥防治代謝性疾病研究，E-mail：wangyuxh@163.com

通信作者：張冰（1959.08—），女，博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥防治代謝性疾病研究，E-mail：zhangbing6@263.net