努爾凱麥爾·木拉提 楊亞杰 帕爾哈提·阿布都克日木 瑪依努爾·吾斯曼

摘要：測定植物葉綠素含量有多種方法，以小麥為材料，在前人研究的基礎(chǔ)上，驗證長勢相近的小麥葉片在同等試驗條件之下，比較測定葉綠素含量的6種方法。結(jié)果表明，原子吸收光譜法所測得的葉綠素含量最高且結(jié)果最準(zhǔn)確、可靠;浸提法所得的葉綠素含量也較高但時間過長;研磨法結(jié)果偏低且過程繁瑣;葉綠素儀法并不適合作為精確測量葉綠素含量的方法。所測葉綠素含量從高到低依次為原子吸收光譜法>無水乙醇浸提法>80%乙醇浸泡法>95%乙醇研磨-過濾法>95%乙醇研磨-離心法>葉綠素儀法。此結(jié)論可為其他研究者提供一定的參考價值。

關(guān)鍵詞：小麥;葉綠素;原子吸收光譜法;浸泡法;研磨法

中圖分類號： S512.101 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0156-04

小麥（Triticum aestivum L.）是一種糧食作物，其產(chǎn)量的提高可以極大地推動農(nóng)業(yè)發(fā)展。而影響小麥產(chǎn)量最重要的因素是其中的葉綠素含量，葉綠素含量常作為評定植物適應(yīng)環(huán)境能力和生長狀況的一個重要項目[1]。因此小麥葉綠素含量測定的研究就顯得格外重要，其測定方法有很多，但是對各種方法的比較卻鮮見報道。針對這一現(xiàn)象，筆者所在課題組把各種方法進(jìn)行比較找出各自優(yōu)缺點，并在筆者所在實驗室進(jìn)行相關(guān)方法的葉綠素含量測定。以期為他人選擇最適合的方法測定葉綠素含量提供參考，為合理試驗、科研奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥種子的處理

取預(yù)先準(zhǔn)備好的小麥種子，從中選取顆粒飽滿的種子，自來水沖洗表面灰塵和雜質(zhì)后備用;用自來水將120 mm培養(yǎng)皿沖洗干凈，晾干，放上2～3張濾紙，用水打濕。將備用的小麥種子平鋪在濾紙上，放入4～5個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，放到陽光充足、溫度適宜的地方進(jìn)行培養(yǎng)，隔3～4 h澆1次水。觀察小麥生長情況，待小麥苗長至5 cm時移到花盆中進(jìn)行后續(xù)生長，待小麥葉片蔥綠，高度約10 cm時準(zhǔn)備進(jìn)行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 95%乙醇研磨-過濾法 取新鮮干凈小麥葉片，稱量0.4 g于研缽中剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4～6 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，繼續(xù)加入95%乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨?，靜置一段時間，取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁，用乙醇潤濕，玻璃棒置于濾紙3層處，把勻漿沿玻璃棒引流，過濾到 50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇洗研缽及玻璃棒，一并轉(zhuǎn)入，最后用95%乙醇定容至50 mL，重復(fù)2次。

取潔凈比色皿（用手拿住比色皿的糙面），先用少量待測液清洗2～3次，然后將溶液倒入比色皿中（高度不得超過比色皿總高的4/5），將灑出的溶液用濾紙吸掉，第1個比色皿中放95%乙醇溶液為空白對照。然后測定其在波長663 nm和645 nm處的吸光度。每個重復(fù)在不同波長下測3次，取平均值。

1.2.2 95%乙醇研磨-離心法 取新鮮干凈小麥葉片，稱取0.5 g于研缽中剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及3 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，再加95%乙醇3～5 mL，靜置一段時間，將勻漿轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，并用適量95%乙醇洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入，然后以4 000 r/min離心10 min后，棄沉淀，上清液用95%乙醇定容至10 mL，重復(fù)2次。

取上述色素提取液2 mL，加95%乙醇16 mL稀釋得到待測液;測定與計算方法同“1.2.1”節(jié)。

1.2.3 無水乙醇浸提法 稱取新鮮干凈小麥葉片0.02 g，將其剪成長度約5 mm、寬度約1 mm的細(xì)絲。將準(zhǔn)備好的細(xì)絲等量分別放入3支試管中（試管用黑塑料袋包裹），滴加10 mL無水乙醇，室溫下暗處浸泡提取3 d左右，期間加以搖晃可縮短浸泡時間，至小麥葉片無色或白色。

將提取液再次定容至10 mL;測定與計算方法同“1.2.1”節(jié)，其中空白對照為無水乙醇。

1.2.4 80%乙醇浸提法 步驟同“1.2.3”節(jié)，只需用80%乙醇溶液替代無水乙醇即可。

1.2.5 葉綠素儀法 手持CM-1000葉綠素測量儀，距離小麥葉片30.5～183.0 cm，打開開關(guān)，即可進(jìn)行掃描，等數(shù)據(jù)出現(xiàn)后進(jìn)行記錄，間隔2 s就可以進(jìn)行下一次測量，重復(fù)3次取平均值。

1.2.6 原子吸收光譜法 鎂標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將配制好的1.000 mg/mL鎂儲備液稀釋至 10.00 μg/mL，得到鎂標(biāo)準(zhǔn)溶液。移此溶液0、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 mL于6個50 mL的容量瓶中，再分別滴加20 mL 0.8 mol/mL HCl溶液，用蒸餾水定容。得濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，以濃度為0的溶液作為空白對照，測定標(biāo)準(zhǔn)液在285 nm處的吸光度，分別為0.015、0.116、0.245、0.418、0.552、0.743，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性函數(shù)為y=0.726 5x+0.033 3，見圖1。

取新鮮干凈小麥葉片，稱取約2.0 g剪碎，加入少許石英砂和碳酸鈣粉及4～6 mL無水乙醇，研磨成勻漿，繼續(xù)加入無水乙醇研磨至組織變?yōu)榘咨?，靜置一段時間，取1張干凈濾紙放于漏斗內(nèi)壁，用乙醇潤濕，玻璃棒置于濾紙3層處，把勻漿沿玻璃棒引流，過濾到50 mL棕色容量瓶中，用乙醇洗研缽及玻璃棒，一并轉(zhuǎn)入，最后用無水乙醇定容至50 mL，重復(fù)2次。得到小麥葉綠素提取液，置于避光處備用。

取上述葉綠素提取液4.0 mL于分液漏斗中，滴加4.0 mL石油醚，輕輕搖動;再加4.0 mL NaCl溶液，上下振蕩;再加入12.0 mL蒸餾水，充分振蕩以后靜置分層，深綠色的石油醚層在上層，水-乙醇層在下層。從下面倒出水-乙醇層，再用4.0 mL石油醚重復(fù)萃取2次，然后合并3次所得到的石油醚相。于其中加入20 mL 0.8 mol/L的HCl溶液，充分振蕩后放置分層，將水相轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，得到待測液。

2 結(jié)果與分析

由表1可見，95%乙醇研磨-過濾法所測得的葉綠素含量高于95%乙醇研磨-離心法;無水乙醇浸提法所測得的葉綠素含量高于80%乙醇浸提法;浸提法所測得的葉綠素含量均高于研磨法;葉綠素儀法無法測出葉綠素a、葉綠素b含量。原子吸收光譜法測得的葉綠素總量為（4.025±0.110） mg/g，其所測得的葉綠素總量最高，且標(biāo)準(zhǔn)差也最小，所以此方法所測結(jié)果最準(zhǔn)確，但缺點是無法測出葉綠素a、葉綠素b的含量。

小麥葉片在經(jīng)過95%乙醇溶液研磨之后，過濾法與離心法測得的葉綠素含量有明顯差異。過濾法所測得的含量高于離心法，說明在離心的過程中，勻漿從研缽轉(zhuǎn)移到離心管以及葉綠素提取液從離心管轉(zhuǎn)移到試管的過程中，小麥葉綠素遭到光、氧的損傷，同時還存在溶液灑出的情況，導(dǎo)致離心法測得的含量偏低;而在過濾的過程中，并沒有頻繁的轉(zhuǎn)移過程，直接過濾定容到容量瓶即可，可避免葉綠素的損失。

乙醇作為提取劑來浸泡小麥葉片，不同濃度乙醇處理測得的葉綠素含量不同，可知提取劑濃度會影響葉綠素含量的測定。在相同條件之下，采用無水乙醇浸泡比80%乙醇浸泡測定效果更好，說明乙醇濃度越低其含水量越高，葉綠素在其提取劑中的溶解度降低，所以測得的葉綠素含量降低。

浸提法測得的數(shù)據(jù)均比研磨法高，說明浸提法對小麥葉片的損害較少。在研磨過程中，研磨時間過長使葉綠素受到光解，且過程比較繁瑣，既要進(jìn)行研磨，還有后續(xù)的過濾或離心處理，葉綠素含量會發(fā)生一定的減少。而浸提法只需將小麥葉片剪成細(xì)絲狀就可以直接放入浸提液中反復(fù)浸泡，至葉絲變白或無色即可，過程較簡單，且所測含量也較高。

葉綠素儀法測得的結(jié)果是最低的，因為在測量過程中，CM-1000葉綠素儀所要求的待測植物的面積直徑最低應(yīng)為1.35 cm，而試驗中所采用的小麥葉片由于生長時間較短，寬度僅為0.2～0.4 cm;又因為使用葉綠素儀測定時，小麥葉片呈現(xiàn)一定程度的發(fā)黃現(xiàn)象，導(dǎo)致最終結(jié)果偏低。說明此方法無法測出準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，但是它的整個試驗過程極其簡單，對待測樣品也沒有嚴(yán)格的處理要求，只需保持一定的距離進(jìn)行掃描即可得出葉綠素含量。

原子吸收光譜法所測得的葉綠素總量為 4.025 mg/g，為6種方法中測得含量的最高值，且準(zhǔn)確性也是最可靠的，因為通過間接測定葉綠素中鎂元素的濃度進(jìn)而測定葉綠素含量，在其過程中可以減少葉綠素的降解和損失問題。但試驗過程中也存在一些誤差，比如葉綠素提取液的制備采用的是研磨法，存在一定程度的光解。但是與其他方法相比，此方法所用的火焰原子吸收光光度計能夠靈敏可靠地測定鎂元素的吸光度，所以其準(zhǔn)確性仍是最高，誤差也最小。

3 結(jié)論與討論

在測定小麥葉綠素含量的6種方法中，原子吸收光譜法雖不是直接測定葉綠素含量的方法，但是其測定過程是對葉綠素中鎂元素進(jìn)行直接測定，測定鎂元素的吸光度與直接測定葉綠素吸光度相比，其操作過程不存在葉綠素的降解，所以它的測定結(jié)果是最可靠、最準(zhǔn)確的。無水乙醇浸提法所得結(jié)果較準(zhǔn)確但時間最長;葉綠素儀法是粗略估計但時間最短;研磨法是傳統(tǒng)方法且一直沿用至今，但是過程繁瑣，需耗時耗力。另外，浸提法、研磨法以及原子吸收光譜法都是對待測樣品進(jìn)行離體檢測，在此過程中也存在對待測樣品不同程度的損傷，而葉綠素儀法則是活體檢測，無需采摘;同時葉綠素儀法和原子吸收光譜法只能測出小麥的葉綠素總量，無法測出葉綠素a、葉綠素b含量。

葉綠素含量是所有植物十分重要的生理指標(biāo)之一[2]，一直以來以傳統(tǒng)的研磨法應(yīng)用最為廣泛，深受各位研究者的青睞，本次研究也采用了研磨法，得知了其對葉綠素含量的影響，以及其他方法對含量測定的影響。

在研磨-過濾和研磨-離心2種方法的操作過程中，考慮到過濾法比較耗時和乙醇揮發(fā)較快的原因，所以同時做了離心試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離心所測的含量比過濾法還要低。但總體來講，研磨法與其他方法相比，表現(xiàn)為步驟瑣碎、工作量大、在研磨過程中對小麥葉片易有損傷且很容易受光氧化分解，并且無法防止試驗者不與揮發(fā)到四周空氣中的藥品接觸，對身體有較大的傷害[3]。所以，有人對此種方法進(jìn)行了改進(jìn)[4]，但是由于對待測樣品的提取不徹底、效率低以及提取劑不穩(wěn)定等因素而未被廣泛使用[5]。所以研磨法從嚴(yán)格意義上來說，其測量結(jié)果偏低，也比較麻煩，并不適宜用來測定葉綠素含量，但是它作為測量植物葉綠素含量的鼻祖，必將會一直沿用下去，并且對于教師的試驗教學(xué)過程還是比較適宜的。

用浸提法來進(jìn)行小麥葉綠素含量測定時，使用了2種不同濃度的同一種提取劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高濃度組所測的含量比較高且準(zhǔn)確。但這并不能說明提取劑濃度與所測葉綠素含量表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，如果未來有機會，將會使用乙醇作為單一提取劑，作梯度濃度試驗，以確定最佳乙醇濃度。同時本試驗與洪法水等的丙酮乙醇混合液作為浸泡液的試驗[6]作比較，發(fā)現(xiàn)其效果相對偏低;與王文杰等的二甲基亞砜法浸泡提取葉片葉綠素相比[7]，其時間相對較長。但是浸提法所測得的含量在6種方法當(dāng)中也是明顯較高的，且極易進(jìn)行操作，對試驗也沒有藥品暴露風(fēng)險，個人覺得比較適合于本科及碩士課程的研究。

EYELHCM-1000葉綠素儀法作為一種測定植物相對葉綠素含量極其簡便的方法，由于結(jié)果不準(zhǔn)確，故參考價值不大。但是此方法卻很簡單易測，并且儀器也很方便攜帶，同時也有研究表明，經(jīng)過校正的葉綠素儀能對田間生長的植物的葉綠素含量進(jìn)行準(zhǔn)確快速的測定[8]。若待測植物的葉片面積可以達(dá)到儀器的要求，那么用來測量抽穗期的小麥葉片葉綠素含量還是比較適宜的。

原子吸收光譜法由于是一種間接的方法，很多人并不采用，但是由于其試驗過程很嚴(yán)謹(jǐn)，對藥品的使用量有一定限度，只需把鎂元素從葉綠素中萃取出來，它就不會有損失，如果采用直接方法測葉綠素含量，不可避免的會使待測液中葉綠素降解，導(dǎo)致含量降低。并且本試驗結(jié)果也顯示它所測得的含量最高、最準(zhǔn)確，所以比較適用于科學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]周小生，周月琴，龐 磊，等. 葉綠素儀CCM-200在測定茶樹葉片葉綠素和氮素含量上的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，39（1）：150-153.

[2]徐芬芬，葉利民，徐衛(wèi)紅，等. 小白菜葉綠素含量的測定方法比較[J]. 北方園藝，2010（23）：32-34.

[3]黃 帆，郭正元，徐 珍. 測定浮萍葉綠素含量的方法研究[J]. 實驗技術(shù)與管理，2007，24（5）：29-31.

[4]陳福明，陳順偉. 混合法測定葉綠素含量的研究[J]. 林業(yè)科訊，1984（2）：4-8.

[5]彭運生，劉 恩.關(guān)于提取葉綠素方法的比較研究[J]. 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1992，18（3）：247-250.

[6]洪法水，魏正貴，趙貴文. 菠菜葉綠素的浸提和協(xié)同萃取反應(yīng)[J]. 應(yīng)用化學(xué)，2001，18（7）：532-535.

[7]王文杰，賀海升，關(guān) 宇，等. 丙酮和二甲基亞砜法測定植物葉綠素和類胡蘿卜素的方法學(xué)比較[J]. 植物研究，2009，29（2）：224-229.

[8]張憲政. 植物葉綠素含量測定方法比較研究[J]. 沈陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1985，16（4）：81-84.