楊俊芳 曹越 王宙 王亞 張宏斌 趙宜婷 王宏偉

摘要：為了篩選最佳構(gòu)建蓖麻高密度遺傳圖譜的親本組合，以農(nóng)藝性狀差異較大的蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH3和HCH1分別為母本，基于全基因組重測序（WGS）技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對2組親本進(jìn)行SNP標(biāo)記多態(tài)性分析。結(jié)果表明，2組親本間多態(tài)性標(biāo)記均比較豐富，其中以HCH1為母本的組合2的親本多態(tài)性更佳，SNP多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為581 158個，可用aa×bb型SNP標(biāo)記為181 791個。最佳親本組合的確定為構(gòu)建蓖麻的高密度遺傳圖譜、多種農(nóng)藝性狀定位和基因挖掘奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蓖麻;全基因組重測序;親本;SNP;多態(tài)性分析

中圖分類號：S563.903.2 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）09-0053-05

蓖麻（Ricinus communis L.，2n=20），屬于大戟科的單型蓖麻屬[1]，是雌雄同株異花植物，正常株蓖麻花序軸上方為紅色雌花，下方為黃色雄花，圓錐花序，常異花授粉，多級分枝，無限花期。蓖麻是一種重要的能源油料作物，因其蓖麻油具有的特殊物理性質(zhì)，被應(yīng)用于航空、航天、軍工、工程塑料、化工、紡織等數(shù)十個行業(yè)[2]。但是受困于蓖麻傳統(tǒng)育種的局限性，在選擇具有理想性狀的植株，特別是多基因控制性狀時，需要很長時間且缺乏精確性，蓖麻品種改良進(jìn)程緩慢。分子標(biāo)記輔助育種（MAS）方法可以有效地解決這些問題。遺傳圖譜和數(shù)量性狀定位（QTL）已成為多種植物分子標(biāo)記輔助育種的重要工具[3-8]。

在蓖麻上關(guān)于遺傳圖譜構(gòu)建的研究起步較晚，研究者也較少。國內(nèi)學(xué)者畢川等最早開始蓖麻圖譜構(gòu)建工作[9]，2016年構(gòu)建了第1張相對完整的遺傳圖譜[10]，共331個標(biāo)記（317個SSR、7個SRAP標(biāo)記、3個SSRAP標(biāo)記、3個形態(tài)學(xué)標(biāo)記、1個ISSR標(biāo)記）分布在10個連鎖群上，覆蓋 1 164.73 cM 基因組，平均標(biāo)記間隔為3.63 cM。2019年又新構(gòu)建了1張SSR標(biāo)記遺傳圖譜并對蓖麻雌性復(fù)雜性狀進(jìn)行了定位[11]。2016年Tomar等通過遺傳群體篩選出 141 個（RAPD、 ISSR、SSR）標(biāo)記，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，找到了關(guān)于蓖麻抗枯萎病的2個 QTLs[12]。2017年Tomar等篩選出 336 個（RAPD、ISSR、SSR） 標(biāo)記，構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜，并定位到了與蓖麻木炭腐病相關(guān)的新型QTLs[13]。2019年Yu等基于GBS測序技術(shù)對200個重組自交系（RIL）群體進(jìn)行測序分析，構(gòu)建了10個連鎖群（LGs）的高分辨率遺傳圖譜包含8 896個高質(zhì)量的SNPs，覆蓋1 852.33 cM基因組，篩選到了16個控制種子大小和質(zhì)量的QTLs[14]。

近年來，隨著第2代測序技術(shù)迅速發(fā)展和測序成本的降低，高通量測序技術(shù)為植物基因型鑒定和遺傳作圖帶來了方法上跨越式的突破[15]。以SNP 標(biāo)記為代表的新一代分子標(biāo)記大批量地用于植物高密度遺傳圖譜的構(gòu)建[16-19]。傳統(tǒng)的SSR、RAPD、AFLP、RFLP等分子標(biāo)記上圖量少，標(biāo)記間遺傳距離較大、基因組覆蓋率低，而SNP標(biāo)記的上圖量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)分子標(biāo)記，圖譜分辨率高、定位精度高。蓖麻全基因組測序完成于2010年，形成了蓖麻的第1張基因草圖，基因組大小約350 M，組裝水平為Scaffold，Scaffolds有25 763條[20]。蓖麻測序工作的完成為開展蓖麻基因組水平的研究奠定了基礎(chǔ)，但是由于蓖麻基因組組裝水平并未到染色體，而且Scaffolds也比較多，組裝水平還遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于很多作物。據(jù)此可以借助構(gòu)建高密度遺傳圖譜的方法，對蓖麻的多種農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位，挖掘相關(guān)基因，加快蓖麻分子標(biāo)記輔助育種的進(jìn)程。而且高密度的遺傳圖譜可以輔助基因組組裝，提高全基因組精細(xì)圖譜完整性。

本研究以農(nóng)藝性狀差異較大的蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH3和HCH1為母本分別構(gòu)建F1、F2、BC1群體?；谌蚪M重測序（WGS）技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法對2組親本進(jìn)行SNP標(biāo)記多態(tài)性分析，以便篩選出最佳組合，為構(gòu)建蓖麻高密度遺傳圖譜奠定良好的基礎(chǔ)，進(jìn)而對蓖麻多種農(nóng)藝性狀進(jìn)行QTL定位和基因挖掘。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以蓖麻兩性系SL1為父本，鑲嵌型雌性系HCH1和HCH3為母本，2017年分別雜交收獲F1，2018年F1自交收獲F2、與母本回交收獲BC1。父本SL1為綠稈、密刺、中稈、早熟、花籽的正常兩性株，且雄花比例極大，單株主穗甚至無雌花，僅在分枝穗上有少量雌花。母本1：HCH3為紅稈、無刺、高稈、晚熟、小黑籽有極少量鑲嵌雄花雌性系。母本2：HCH1為紅稈、密刺、高稈、晚熟、小黑籽有少量鑲嵌雄花的雌性系。2019年5月將3個親本材料、F2及回交BC1群體種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）經(jīng)濟作物研究所，正常田間管理。

1.2 基因組DNA提取及測序

用剪刀取幼嫩蓖麻葉片0.1～0.5 g，用植物基因組DNA提取試劑盒（Solar Bio）提取每個樣品的基因組DNA。利用Eppendorf AG 22331蛋白/核酸分析儀（Eppendorf公司，德國）檢測DNA濃度及純度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。按照高通量測序的要求，每樣品的DNA總量≥1 μg，濃度≥50 ng/μL;樣品純度D260 nm/280 nm為1.8～2.0，D260 nm/230 nm為1.9～2.4。電泳結(jié)果主帶清晰，無降解，可用于高通量測序。檢驗合格的DNA樣品寄送北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行建庫，并利用illumina HiSeqTM PE150進(jìn)行測序。

1.3 信息分析方法

原始測序數(shù)據(jù)基于Raw data進(jìn)行質(zhì)量評估，去除掉包含接頭信息、低質(zhì)量堿基、未測出的堿基（以N表示）等干擾信息，最終得到有效數(shù)據(jù)，即Clean data 或 Clean reads。經(jīng)質(zhì)控過濾后的有效測序數(shù)據(jù)通過 BWA 軟件（參數(shù)：mem-t4-k32-M）比對到蓖麻參考基因組（蓖麻全基因組數(shù)據(jù)庫TIGR，http：//castorbean.jcvi.org/downloads.php），比對結(jié)果經(jīng) SAMTOOLS 去除重復(fù)（參數(shù)：rmdup）。采用GATK等軟件進(jìn)行群體SNP的檢測。

1.4 親本間標(biāo)記開發(fā)

基于蓖麻親本基因型檢測結(jié)果，進(jìn)行親本間多態(tài)性標(biāo)記開發(fā)。過濾掉親本信息缺失的位點，篩選父母本間具有多態(tài)性的位點，并從中篩選出符合F2群體作圖標(biāo)記類型的位點。用于F2群體作圖的標(biāo)記類型為aa×bb型，篩選父母本都為純合且親本間具有多態(tài)性的位點，即在某個SNP位點親本1基因型為GG，親本2基因型為AA，親本基因型都為純合，且親本間基因型不相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及質(zhì)量評估

對經(jīng)過嚴(yán)格質(zhì)控過后的親本測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計（表1），可以看出母本2的堿基數(shù)最大，達(dá)到了947×109 bp。父本次之，為8.64×109 bp。母本1的堿基數(shù)最少，為8.58×109 bp。3個親本的有效數(shù)據(jù)產(chǎn)量均達(dá)到了99.8%以上，測序錯誤率同為004%，Q20、Q30、GC含量也達(dá)到了測序要求。最終獲得了高質(zhì)量的Clean data，能夠順利進(jìn)行下一步的比對工作。

2.2 Reads與參考基因組比對情況

蓖麻參考基因組大小為 336 968 299 bp。3個親本的比對率在98%以上，對參考基因組（排除N區(qū)）的平均覆蓋深度在20X以上，1X覆蓋深度（至少有1個堿基覆蓋）95.73%及以上，4X覆蓋深度（至少有4個堿基覆蓋）在92.35%及以上。親本比對結(jié)果正常（表2），可用于后續(xù)的變異檢測及多態(tài)性分析。

2.3 親本SNP檢測結(jié)果

將比對到蓖麻基因組上的reads挑選出來，采用 GATK對數(shù)據(jù)進(jìn)行群體SNP的檢測，統(tǒng)計得到的SNP相關(guān)信息。父本和母本2的SNP標(biāo)記總數(shù)和純合標(biāo)記數(shù)量均高于母本1。親本SNP檢測結(jié)果見表3。

2.4 標(biāo)記多態(tài)性分析

以父本SL1和母本HCH3（母本1）為雜交組合1構(gòu)建F2群體，多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為542 928個，可用aa×bb型標(biāo)記為171 829個（表4）。以父本SL1和母本HCH1（母本2）為雜交組合2構(gòu)建F2群體，多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為581 158個，可用aa×bb型標(biāo)記為181 791個（表5）。通過2個雜交組合間不同類型標(biāo)記數(shù)量比較，可見由父本SL1和母本HCH1（母本2）搭配的組合2的總標(biāo)記數(shù)和可用型標(biāo)記數(shù)都較優(yōu)。這與田間觀察到的表型性狀分離情況也一致，組合2構(gòu)建的F2群體、BC1群體分離的多樣性比組合1更豐富。同時，通過表4和表5明顯看出aa×bb型標(biāo)記并不是最多的標(biāo)記，hk×hk類型標(biāo)記最多，超過25萬個，在組合1中同樣存在類似的問題。由于hkxhk與nnxnp、lmxll型標(biāo)記均適用于由雜合親本構(gòu)建的F1作圖群體。而本試驗的親本均為純合，且構(gòu)建的為F2作圖群體，故同一組合間不同標(biāo)記數(shù)量的比較沒有太大的參考價值，本試驗僅對不同組合間的同一aa×bb型標(biāo)記進(jìn)行比較分析。

3 討論與結(jié)論

在構(gòu)建遺傳圖譜前首先要確定親本組合，若親本材料選取不當(dāng)， 會直接影響圖譜的質(zhì)量以及準(zhǔn)確性[21]。傳統(tǒng)遺傳圖譜構(gòu)建親本組合的確定，需經(jīng)過分子標(biāo)記多態(tài)性篩選[22-25]，高密度遺傳圖譜構(gòu)建親本的選擇同樣也需要進(jìn)行標(biāo)記多態(tài)性分析。

2018年花生上基于WGS技術(shù)對2個親本及91個RIL群體進(jìn)行測序，構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間總的SNPs標(biāo)記數(shù)為97 571個，可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為18 252個，最終上圖標(biāo)記數(shù)為8 869個，覆蓋3 120 cM基因組，平均遺傳距離1.45 cM[26]。2018年大豆上基于SLAF測序技術(shù)對親本和149株RILs個體進(jìn)行測序，構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間總的SNPs標(biāo)記數(shù)為391 476個，可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為53 132個，最終上圖標(biāo)記數(shù)為5 111個，覆蓋 2 909.46 cM 基因組，平均遺傳距離0.57 cM[27]。2019年在胡蘿卜上基于WGS技術(shù)對2個親本及137個F2群體進(jìn)行測序，構(gòu)建了超高密度遺傳圖譜，親本間可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為411 891個，最終上圖標(biāo)記為378 738個，覆蓋1 306.8 cM基因組，平均遺傳距離0.46 cM[28]。2020年在煙草上基于WGS技術(shù)構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，親本間可用多態(tài)性SNPs標(biāo)記為1 626 811個，最終上圖標(biāo)記為 45 081 個，遺傳距離為3 486.78 cM，平均遺傳距離0.495 cM[29]。本研究中獲得的組合1親本間多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為542 928個，可用多態(tài)性標(biāo)記為 171 829 個;組合2親本間多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為 581 158 個，可用多態(tài)性標(biāo)記為181 791個。最終的上圖標(biāo)記量還需要經(jīng)過對F2群體多態(tài)性標(biāo)記分析，之后再過濾掉一部分缺失的、偏分離的標(biāo)記才能確定。但是目前來看，通過2組親本間的可用多態(tài)性標(biāo)記分析，進(jìn)一步對2個組合子代F2群體進(jìn)行重測序均是可行的。相比較而言，組合2優(yōu)于組合1。

在群體構(gòu)建親本選擇恰當(dāng)?shù)幕A(chǔ)上，通過高通量測序獲得的SNP標(biāo)記構(gòu)建的圖譜質(zhì)量一般要遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)標(biāo)記圖譜。然而通過選擇不同的測序技術(shù)、測序群體種類和大小獲得的圖譜質(zhì)量會有很大差異。測序方法上常用到的有全基因組測序和簡化基因組測序，簡化基因組測序技術(shù)根據(jù)文庫構(gòu)建的不同原理又分為RAD、GBS、2b-RAD、ddRAD、SLAF測序技術(shù)[30]。理論上同一群體利用全基因組測序比簡化基因組測序獲得的圖譜質(zhì)量更高。但全基因測序的方法在成本上比簡化基因組測序要高很多，因此簡化基因組測序要比全基因組測序應(yīng)用得更多。近年來玉米[31]、大豆[32]、花生[33]、芝麻[34]、紅豆[35]、向日葵[36]、甜瓜[37]等多種作物均有用簡化測序技術(shù)的研究成果。蓖麻基因組相對于其他作物較小，在測序成本方面利用全基因組測序技術(shù)相比其他作物更具有優(yōu)勢。

本研究通過對3個親本的全基因重測序及親本間的標(biāo)記多態(tài)性分析表明，2組親本間多態(tài)性標(biāo)記都比較豐富，均可用來作為構(gòu)建高密度遺傳圖譜的親本。組合1親本多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為542 928個，可用aa×bb型標(biāo)記為171 829個。組合2親本多態(tài)性標(biāo)記總數(shù)為581 158個，可用aa×bb型標(biāo)記181 791。經(jīng)比較確定了以SL1為父本和HCH1為母本的組合2為最佳親本組合。最佳親本的確定為構(gòu)建蓖麻的高密度遺傳圖譜及進(jìn)行多種農(nóng)藝性狀定位和基因挖掘奠定了良好的基礎(chǔ)。

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