歐美賢，張美微，于凡，忻亮，張夢琪，趙銀霞，賈晶瑩，李水軍，余琛，繆怡，陸優(yōu)麗

(上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院，上海 200031)

伏立康唑(voriconazole，VRC)是一種三唑類抗真菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性高等特點(diǎn)，是深部曲霉菌感染治療的首選，也是經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療的首選[1-2]。VRC是臨床治療侵襲性真菌感染的高效藥物，對大多數(shù)真菌均有效，且不良反應(yīng)較少，但臨床用藥具有一定局限[3-4]。VRC在體外穩(wěn)定性較高[5]，但在人體內(nèi)血藥濃度影響因素較多，個(gè)體間血藥濃度差異較大，易受其他藥物、病理生理因素影響。VRC的藥代動(dòng)力學(xué)呈非線性特點(diǎn)，劑量與濃度缺乏相關(guān)性，即使給藥劑量發(fā)生微小變化，也可能對藥物半衰期和血藥濃度產(chǎn)生較大影響。有研究顯示，VRC的游離藥物濃度(Cu)與Ct、蛋白質(zhì)濃度、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平、CYP2C19代謝類型及聯(lián)合應(yīng)用高血漿蛋白結(jié)合率藥物顯著相關(guān)[6]。臨床推薦對肝功能不全、聯(lián)合應(yīng)用影響VRC藥代動(dòng)力學(xué)藥物、CYP2C19基因突變、發(fā)生不良事件或療效欠佳、重癥真菌感染危及生命的患者進(jìn)行VRC血藥濃度監(jiān)測，對提高感染性疾病治愈率、減少或避免毒性反應(yīng)的發(fā)生具有十分重要的臨床意義[7-8]。

目前對VRC進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測已達(dá)成國際共識(shí)[9-10]。酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(EMIT)可用于測定VRC血藥濃度，但該方法測定值高于超高效液相色譜(UPLC)法，可能與VRC代謝物干擾及聯(lián)合用藥有關(guān)[11]。有研究顯示，在VRC血藥濃度監(jiān)測中，UPLC-紫外分光光度法較免疫測定法靈敏[12]。此外，也有研究使用瓊脂擴(kuò)散生物測定法測定VRC血藥濃度，但微生物瓊脂擴(kuò)散法的總體線性不如UPLC[13]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法通過直接檢測目標(biāo)分析物，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，可作為檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)。然而目前報(bào)道的UPLC檢測方法分析時(shí)間普遍較長，本研究擬建立靈敏度高、準(zhǔn)確度好、分析時(shí)間較短的UPLC-MS/MS法測定VRC血藥濃度，從而縮短檢驗(yàn)結(jié)果回報(bào)時(shí)間，以滿足臨床及時(shí)調(diào)整患者給藥方案的需求。UPLC-MS/MS法建立后可用于不同分析方法的比較，參與室間質(zhì)評活動(dòng)。此外，本研究利用UPLC-MS/MS法檢測不同年齡中國人群VRC血藥濃度水平，為后續(xù)建立針對LC-MS/MS法的VRC血藥濃度參考區(qū)間提供支持。

1 材料和方法

1.1 儀器

API 4000串聯(lián)質(zhì)譜儀(Applied Biosystems公司)，液相系統(tǒng)LC-30AD(Shimadzu公司)，色譜柱Phenomenex Luna?Omega C18100A(2.1 mm×50.0 mm，1.6 μm)，預(yù)柱Waters Quality Parts ASSY FRIT(2.1 mm，0.2 μm)。Vortex-2 渦旋混合器(Scientific Industries 公司)，Mikro 22R 冷凍高速離心機(jī)(Hettich 公司)，超聲波清洗器(上海必能信超聲波儀器廠)，可調(diào)式移液器及連續(xù)分配移液器(Eppendorf)，離心機(jī)(5430R Eppendorf)，分析天平(CP225D Sartorius)，冰箱(HYC-360青島海爾公司)，純水儀(Milli-Q Advantage A10 Millipore)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

VRC(TRC公司，純度98%)，VRC同位數(shù)(VRC-d3，TRC公司，同位素豐度99.6%)，甲酸(液相色譜純)購自Tedia公司，乙腈(液相色譜純)及甲醇(液相色譜純)購自Merck KGaA公司，實(shí)驗(yàn)用水采用Millipore純水系統(tǒng)自制。

1.3 色譜條件

采用Phenomenex Luna?Omega C18100A(2.1 mm×50 mm，1.6 μm)色譜柱，0.1%甲酸-40%乙腈水溶液等度洗脫?？傔\(yùn)行時(shí)間1.5 min，使用了切換閥，0.8～1.3 min使流動(dòng)相進(jìn)質(zhì)譜分析，其余時(shí)間排至廢液，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)正離子掃描模式，選擇MRM掃描方式，電噴霧電壓5 500 V，溫度550 ℃。GS1 60 psi，GS2 60 psi，氣簾氣30 psi，碰撞氣12 psi，去簇電壓(DP) 90 V，入口電壓(EP) 5 V，碰撞能(CE) 24 V，碰撞室出口電壓(CXP) 16 V；高純度氮?dú)猓籚RC選擇母離子(Q1)/碎片離子(Q3)質(zhì)荷比m/z350.2/281.4為定量通道，350.2/224.1為定性通道；VRC-d3(內(nèi)標(biāo))選擇母離子(Q1)/碎片離子(Q3)m/z353.3/284.2通道。

1.5 對照品及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液配制

分別精密稱取VRC、VRC-d3對照品適量于容量瓶中，以50%甲醇水溶液使其全部溶解后定容至刻度，混勻后轉(zhuǎn)移至玻璃瓶，于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品配制

精密量取對照品儲(chǔ)備液適量，用空白人血清配制成80.0、40.0、20.0、4.0、0.8及0.2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)血清樣品和64.0、32.0及1.6 μg/mL質(zhì)控樣品。

1.7 血清樣品預(yù)處理

取血清樣品50 μL置于1.5 mL離心管中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液(200 μg/mL)，再加入200 μL甲醇溶液后漩渦振蕩30 s，15 000 r/min離心10 min，上清液用0.1%甲酸水溶液稀釋25倍混勻后進(jìn)樣2 μL分析。記錄色譜圖中分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.8 臨床樣品收集

VRC開始治療后4～7 d進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，在下一次給藥前抽取靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用UPLC-MS/MS法檢測藥物濃度。本研究對159例患者VRC血藥濃度檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，部分樣本為復(fù)旦大學(xué)附屬中心醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)患者外送樣本，部分樣本為上海市兒童醫(yī)學(xué)中心ICU患者外送樣本，本研究獲得了上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[(2021)科審第(051)號(hào)]。159例患者中，兒童69例，成人90例；男99例，女60例。

2 結(jié)果

2.1 干擾及靈敏度考察

將空白血清樣本、最低定量限(0.2 μg/mL)樣本、臨床樣本(2.21 μg/mL)按“1.7”項(xiàng)下方法對樣本進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析。VRC(m/z350.2/281.4)空白血清樣本、最低定量限及臨床樣本的典型色譜圖，VRC-d3(m/z353.3/284.2)的典型色譜圖見圖1。從圖1可知本方法無明顯干擾，靈敏度較好。

A.空白血清樣本VRC色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察

在空白人血清中加入按“1.6”項(xiàng)下方法制成的80.0、40.0、20.0、4.0、0.8及0.2 μg/mL血清標(biāo)準(zhǔn)樣品，按“1.7”項(xiàng)下方法對樣本進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析。以待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y)對濃度(x)作線性回歸分析，回歸方程為y=0.443x+0.019 8(r=0.999 7)。結(jié)果表明VRC在0.2～80.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與待測物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的線性關(guān)系良好。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

按“1.6”項(xiàng)下方法配制成最低定量限(0.2 μg/mL)、低濃度(1.6 μg/mL)、中濃度(32.0 μg/mL)、高濃度(64.0 μg/mL)的質(zhì)控樣品(n=6)，分別在1天內(nèi)和多天內(nèi)制作3批，按“1.7”項(xiàng)下方法對樣本進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算平均準(zhǔn)確度和批內(nèi)、批間精密度，見表1。各濃度平均準(zhǔn)確度為103.5%～107.3%，批內(nèi)和批間RSD均<10%，表明該方法準(zhǔn)確度高，精密度較好。

表1 準(zhǔn)確度和批內(nèi)和批間精密度

2.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

用空白血清制備低濃度(1.6 μg/mL)、中濃度(32.0 μg/mL)、高濃度(64.0 μg/mL)3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度包括6份平行樣品，按“1.7”項(xiàng)下方法對樣本進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析；另制備18份經(jīng)樣品預(yù)處理的空白基質(zhì)，添加低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控品，使其濃度與低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品預(yù)處理后一致；提取回收率通過比較直接提取后與空白血清提取后加入的分析物或內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值進(jìn)行計(jì)算。取6份不同來源的空白血清基質(zhì)，通過計(jì)算由空白血清基質(zhì)提取后加入低濃度(1.6 μg/mL)、中濃度(32.0 μg/mL)及高濃度(64.0 μg/mL)VRC測得的峰面積，與不含血清基質(zhì)相應(yīng)濃度測得的峰面積比值，獲得分析物或內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)因子。VRC和VRC-d3的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表2。低、中、高3個(gè)濃度VRC提取回收率為95.20%～98.27%，VRC-d3提取回收率為97.12%～99.73%；低、中、高3個(gè)濃度的VRC基質(zhì)因子效應(yīng)為0.97～1.00，VRC-d3的基質(zhì)因子為0.98～1.01；RSD均<10%。

表2 VRC和VRC-d3的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)

2.5 殘留分析

為考察樣品在進(jìn)樣過程中的殘留情況，標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)進(jìn)樣后跟隨一個(gè)空白血清樣品，空白血清樣品的分析物平均峰面積不大于該批次最低定量限分析物平均峰面積的20%?？疾斓目瞻籽鍢悠返膬?nèi)標(biāo)平均峰面積在該批次最低定量限內(nèi)標(biāo)平均峰面積的5%以內(nèi)?？疾炫畏治鑫锛皟?nèi)標(biāo)的殘留符合要求。

2.6 室間質(zhì)評

參與美國病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)2019年上半年(樣本編號(hào)AFD-01～AFD-03)及2019年下半年(樣本編號(hào)AFD-04～AFD-06)的室間質(zhì)評活動(dòng)。本研究檢測結(jié)果與均值的偏差為-7.74%～-0.85%，見表3。

表3 LC-MS/MS法VRC兩次CAP室間質(zhì)評結(jié)果 μg/mL

2.7 臨床樣品檢測結(jié)果

159例患者VRC血藥濃度檢測結(jié)果顯示48.5%的VRC血藥濃度不在治療范圍內(nèi)。此外，對159例樣本按年齡分為0～2歲、3～13歲、30～50歲、51～65歲、66～89歲5個(gè)年齡段組，對其VRC血藥濃度作小提琴圖，見圖2。0～2歲組VRC血藥濃度中位數(shù)低于有效濃度下限，但部分樣本達(dá)到了嚴(yán)重中毒濃度；3～13歲組檢測結(jié)果分布廣泛，個(gè)體差異較大；30～50歲組為濃度最集中的一個(gè)組；51～65歲及66～89歲組較其他組濃度更為集中，但部分樣本低于有效濃度，也有部分樣本達(dá)到了嚴(yán)重中毒濃度。

圖2 不同年齡段人群VRC血藥濃度小提琴分布圖

3 討論

侵襲性曲霉菌病(IA)是免疫功能低下患者最常見的危及生命的并發(fā)癥之一，VRC是目前治療IA的首選藥物。然而，一些IA患者免疫功能低下，如治療不及時(shí)常常危及生命，為避免病情惡化需通過治療藥物監(jiān)測調(diào)整VRC劑量[14-15]。UPLC-MS/MS法具有樣品前處理簡便快捷、色譜時(shí)間短、線性范圍廣等優(yōu)勢，適用于實(shí)驗(yàn)室高通量樣本檢測的需求，尤其適用于準(zhǔn)確度要求高、分析時(shí)間短的血藥濃度監(jiān)測[16]。有研究顯示，VRC和IS色譜保留時(shí)間分別為6.4 min和5.6 min[17]。另一項(xiàng)高效液相色譜(HPLC)法檢測VRC血藥濃度的研究中，VRC保留時(shí)間為4.5 min[18]，分析時(shí)間均較長，不利于縮短檢驗(yàn)結(jié)果回報(bào)時(shí)間。本研究所建立的定量檢測VRC方法樣本前處理簡便，為蛋白直接沉淀；VRC保留時(shí)間為1.0 min，單個(gè)樣本液相及質(zhì)譜總運(yùn)行時(shí)間為1.5 min，可用于臨床VRC的血藥濃度快速監(jiān)測和報(bào)告。本研究采用VRC同位素作為內(nèi)標(biāo)，該方法經(jīng)過驗(yàn)證并通過了CAP的室間質(zhì)評測試，方法的準(zhǔn)確度及重現(xiàn)性較好。方法的線性范圍(0.2～80.0 μg/mL)完全覆蓋了本研究的參考范圍(1.0～5.0 μg/mL)，且遠(yuǎn)高于中毒濃度(中毒濃度為>6.0 μg/mL，尤其是>10 μg/mL時(shí))，滿足VRC臨床藥物濃度監(jiān)測的需求。

VRC受人體吸收、代謝等因素影響，不同患者血藥濃度差異較大，尤其是在CYP2C19不同基因型患者體內(nèi)，血藥濃度差異可達(dá)3倍，且同一患者不同給藥時(shí)機(jī)的血藥濃度也有較大波動(dòng)[19]。VRC在人體的安全范圍相對狹窄[20]。有臨床研究顯示，VRC谷濃度≥1.0 μg/mL與治療成功率有關(guān)，但若超過治療窗則神經(jīng)毒性增加[21]。有研究顯示，VRC的肝毒性在亞洲人群中更為普遍，VRC谷濃度≥3.0 μg/mL時(shí)，肝毒性風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[22]。在兒童中，皮疹是最常見的不良反應(yīng)之一，有研究表明兒童剝脫性皮疹可能是VRC體內(nèi)暴露量過高導(dǎo)致的毒性反應(yīng)之一[23]。此外，VRC可能與惡性腫瘤患兒后期可逆性腦白質(zhì)病變相關(guān)[23]。當(dāng)血清VRC血藥濃度因藥物間相互作用而異常升高時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致患者醛固酮缺乏，進(jìn)而發(fā)展為高鉀血癥[24]。本研究回顧性分析了159例患者的VRC血藥濃度，48.5%不在治療范圍內(nèi)，這些患者多為肝功能不全及重癥真菌感染。本研究通過對不同年齡段人群VRC血藥濃度分布分析發(fā)現(xiàn)，人群的個(gè)體差異較大，兒童個(gè)體差異較成人更顯著，尤其是0～2歲低齡兒童，急需VRC血藥濃度監(jiān)測。因此，對肝功能不全及重癥真菌感染患者、兒童及老年人群，尤其是0～2歲低齡兒童開展VRC血藥濃度監(jiān)測，對提高治愈率、減少或避免毒性反應(yīng)的發(fā)生具有十分重要的臨床意義。