劉延亭 ，宮瑞雪 ，張美美 ，代發(fā)文，趙寶凱

（1.北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司 100091；2. 滄州偉嘉畜牧有限公司 061199；3. 樂山師范學(xué)院 614099；4. 沈陽偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司 110144 ）

干擾素( Interferon，IFN) 是一種由同屬動物細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗病毒作用的分泌性糖蛋白，目前被認(rèn)為是先天免疫反應(yīng)的重要組成部分，也是病毒感染的第一道防線［1］。IFN 因在抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等方面具有較好的效果被視為人和動物某些疾病和病毒感染的首選治療性藥物，特別是近些年在治療嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）和新型冠狀病毒[2-3]（2019-nCoV）上面顯示出的突出效果，已越來越受到科學(xué)家們的重視。豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是目前除非洲豬瘟病毒外，威脅我國豬群健康的三個最主要病毒，雖然市場上有較多疫苗種類可供選擇，但仍然無法阻止豬場，特別是小規(guī)模豬場不定時疫病的暴發(fā)，尤其是冬季的PEDV，已對很多養(yǎng)殖場造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在使用疫苗正常免疫的同時，研究相關(guān)抗病毒細(xì)胞因子的抗病毒效果就顯得很有必要，而豬Ⅰ型干擾素中IFN-α因能誘導(dǎo)啟動全身性和系統(tǒng)性的先天性免疫反應(yīng)[4]，已成為多數(shù)養(yǎng)殖人的第一選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬α干擾素原核重組表達(dá)載體pET-32a-PoIFN-α，為本公司實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.1.2 病毒 水泡性口炎病毒（VSV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）NB株、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 細(xì)胞 MDBK細(xì)胞，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。ST、PK15、vero、Marc145細(xì)胞均為本試驗(yàn)保存。

1.1.4 其他試劑 胎牛血清（FBS）和DMEM高糖培養(yǎng)基，均購自Gibco公司；內(nèi)毒素去除試劑盒和內(nèi)毒素凝膠法檢測試劑盒，均購自南京金斯瑞生物科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨購自O(shè)XIOD公司；鎳膠購自康為世紀(jì)有限公司；Tris、氯化鈉等購自國藥。

1.2 方法

1.2.1 重組蛋白表達(dá)與純化 將含pET-32a-PoIFN-α的菌種按培養(yǎng)基總體積的0.5%接種LB液體培養(yǎng)基，同時加入終體積100μg/ml的氨芐青霉素， 37℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600nm達(dá)0.4～0.6左右時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，28℃、200 r/min誘導(dǎo)過夜，收集菌體。離心獲得的沉淀用pH7.9的Tris-HCl緩沖液重懸，超聲破碎后再次離心，上清液用0.45μm濾器過濾，按照親和層析鎳柱純化說明書進(jìn)行純化，洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE測定純度。

1.2.2 內(nèi)毒去除與生物學(xué)活性檢測 將目的蛋白洗脫液經(jīng)ToxinEraserTM樹脂吸收后，再洗脫濃縮，用ToxinSensor?凝膠法內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測樣品中的內(nèi)毒素含量。并參考《中國藥典（2010版）》附錄“干擾素生物學(xué)活性測定法（細(xì)胞病變抑制法）”，以牛腎細(xì)胞（MDBK）和水泡性口炎病毒（VSV）為評價體系，測定純化重組蛋白PoIFN-α的生物學(xué)活性。

1.2.3 安全性測定 采用小鼠試驗(yàn)法，每批樣品用5只小鼠，注射前每只小鼠稱體重，應(yīng)為18～22g。每只小鼠腹腔注射供試品0.5mLl，觀察7d。觀察期內(nèi)，小鼠應(yīng)全部健存，且無異常反應(yīng)，到期時每只小鼠體重均應(yīng)增加，同時設(shè)注射DMEM工作液對照組。

1.2.4 體外抗病毒效果評價

1.2.4.1 培養(yǎng)細(xì)胞 用含10%FBS的DMEM工作液分別稀釋ST、Marc145和Vero細(xì)胞消化液，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/mL，各接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μLl，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)6h。

1.2.3.2 干擾素稀釋 用含7%FBS的DMEM工作液將去除內(nèi)毒素的重組PoIFN-α做10-1、10-2、10-3、10-4稀釋。

1.2.3.3 接種干擾素 棄去96培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，加入干擾素稀釋液，每孔100μL，每個稀釋度做6個重復(fù)，同時設(shè)陰性和病毒陽性對照，37℃、5%二氧化碳條件下繼續(xù)培養(yǎng)18h。

1.2.3.4 病 毒 稀 釋 用 含2%FBS的DMEM工 作 液 分別 稀 釋PRV、PRRSV和PEDV至 預(yù) 定 濃 度，即PRV至100TCID50/0.1mL、PRRSV至100TCID50/0.1mL、PEDV至100TCID50/0.1mL。

1.2.3.5 接種病毒 棄去96孔培養(yǎng)板內(nèi)上清液，每孔分別加入100μl各病毒稀釋液，陰性對照孔加入100μL 含2%FBS的DMEM工作液，于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)24～48h。

1.2.3.6 觀察病變情況，記錄結(jié)果。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組純化蛋白檢測結(jié)果 重組蛋白用SDS-PAGE電泳結(jié)合Bio-Rad Image Lab軟件確定蛋白純度。樣品上樣量不低于1μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳、染色和脫色之后，電泳膠上均只有與目的蛋白分子量相符的條帶，看不到明顯的雜蛋白條帶，且Image Lab軟件分析的純度均在90.0%以上，測定結(jié)果見圖1。

圖1 PoIFN-o重組蛋白純度SDS-PAGE鑒定圖

2.2 內(nèi)毒素及生物學(xué)活性測定結(jié)果 經(jīng)ToxinSensor?凝膠法內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測，去內(nèi)毒素樣品純化液中的內(nèi)毒素含量為50EU/mL；經(jīng)細(xì)胞病變抑制法測定生物學(xué)活性為1.4×109.0U/mL。

2.3 安全性測定結(jié)果 試驗(yàn)組5只小鼠，試驗(yàn)過程當(dāng)中，體重均有增加，證明純化的重組PoIFN-α蛋白對動物安全，與對照組無差異。具體結(jié)果見表1。

表1 安全性測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2.4 體外抗病毒效果評價結(jié)果 重組PoIFN-α蛋白體外抗病毒觀察結(jié)果，具體見表2。從結(jié)果可知，在體外，重組PoIFN-α蛋白對PRV、PRRSV和PEDV均有一定的抑制或延緩病毒增殖的效果。其中，對PEDV的抑制效果最好，重組蛋白即使1000倍稀釋仍然能夠完全抑制PEDV的增殖；重組蛋白高濃度（10倍稀釋）時，對PRRSV也具有完全抑制其增殖的效果。

表2 重組PoIFN-α蛋白體外抗病毒效果評價匯總結(jié)果

3 討論

干擾素是所有抗病毒藥物中最為廣譜、高效、生物學(xué)活性廣泛的特效治療性藥物。除了日常臨床中應(yīng)用于抗病毒作用外，還具有調(diào)節(jié)動物機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的特點(diǎn)，可以刺激多種免疫細(xì)胞如NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生，如用作滅活疫苗佐劑或免疫增強(qiáng)劑[5-7]，對于疫苗的免疫效果具有正向的促進(jìn)作用?？紤]到通過基因工程手段獲得的豬用干擾素?zé)o論是含量或是活性，均高于機(jī)體受病毒或其他干擾素誘生劑刺激產(chǎn)生的干擾素，因此重組豬α干擾素具有極大的研究及推廣潛力。