朱樹蕓, 趙先恩*, 劉虎威

(1. 曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院, 山東省生命有機(jī)分析重點實驗室,山東 曲阜 273165; 2. 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 北京 100871)

人類的許多疾病與暴露于環(huán)境中的大量化學(xué)物質(zhì)有關(guān)。人體接觸環(huán)境中的化學(xué)污染物會導(dǎo)致多種疾病,包括癌癥、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默癥、帕金森病等)等。醛類是高反應(yīng)活性的親電化合物,可與人體多種生物分子(如磷脂、肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶和DNA)形成共價修飾產(chǎn)物而產(chǎn)生毒害作用。2005年,Christopher Wild[1]首次提出“暴露組”概念,以解釋環(huán)境暴露在人類疾病發(fā)病機(jī)制中的作用。自誕生以來,暴露組研究一直是一個前沿?zé)衢T領(lǐng)域?；瘜W(xué)暴露組(chemical exposome)是指人們從胚胎開始就接觸到的化學(xué)污染物的總合。研究表明,暴露組研究可繪制生物標(biāo)志物與疾病風(fēng)險之間的復(fù)雜關(guān)系,因此,所有生物標(biāo)志物的可測量的和特征性的變化共同構(gòu)成了暴露組研究的關(guān)鍵基礎(chǔ)[2-6]。

醛類是化學(xué)暴露組的主要成分之一,在多種疾病的發(fā)病機(jī)理中屬于重要因素之一。醛暴露組(aldehydome)包括所有內(nèi)源性和外源性醛的總和,一方面是生命體在生理、病理、環(huán)境污染物急性損傷等狀態(tài)下產(chǎn)生的內(nèi)源性醛類,另一方面來源于外源性醛類污染物[7,8]。甲醛、乙醛、丙二醛(MDA)等就是人體生理或病理狀態(tài)下的重要醛類化合物。近期,Semerad等[9]監(jiān)測到納米零價鐵暴露的微生物活體體系能夠產(chǎn)生6種醛類損傷標(biāo)志物:甲醛、丙烯醛、甲硫基丙醛、苯甲醛、乙二醛和甲基乙二醛,并且6種醛含量均顯示出與納米污染物劑量的相關(guān)性。環(huán)境污染物雙酚A(BPA)暴露會誘發(fā)人體氧化應(yīng)激,顯著升高人體尿液中的MDA含量[10],是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)或生殖發(fā)育系統(tǒng)等疾病的重要誘因[11,12]。甲醛是中國乃至全世界典型的外源性醛類污染物,能夠?qū)е律窠?jīng)毒性、遺傳毒性、癌癥等[13]。

由于醛類化合物自身物理化學(xué)性質(zhì)和樣品大量基質(zhì)干擾存在,對它們進(jìn)行分析和表征特別困難。醛類化合物的分析檢測方法主要有傳感分析法、電化學(xué)法、熒光成像、色譜法、質(zhì)譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等?；谫|(zhì)譜的分析技術(shù)已廣泛用于生物分析和環(huán)境監(jiān)測研究中,并已成為化學(xué)暴露組研究的主要方法之一[14,15]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)技術(shù),由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)、動態(tài)范圍寬的優(yōu)勢,已成為直接測量生物或環(huán)境樣品中化學(xué)物質(zhì)(包括外源性物質(zhì)、其代謝產(chǎn)物和生物標(biāo)志物)最常用的方法。暴露組質(zhì)譜分析方法主要包括靶向分析法(targeted analysis)和非靶向發(fā)現(xiàn)法(non-targeted profiling)。對于靶向方法,通過復(fù)雜的樣品前處理凈化步驟和使用昂貴的同位素內(nèi)標(biāo),往往能精準(zhǔn)測量一類或幾類已知化學(xué)物質(zhì)。非靶向方法通過犧牲靈敏度來保留廣泛的分析物覆蓋范圍,使該方法在測量低濃度化學(xué)物質(zhì)方面效率降低[5]?；瘜W(xué)衍生化(chemical derivatization),特別是穩(wěn)定同位素標(biāo)記衍生化/化學(xué)同位素標(biāo)記(stable isotope labeling derivatization or chemical isotope labeling)能夠解決代謝組和暴露組LC-MS靶向和非靶向分析工作中的諸多問題[2,16-19],不但能夠使質(zhì)譜檢測靈敏度提高10～1 000倍之多,而且在提高樣品前處理效果、改善色譜分離、增強(qiáng)MS離子化、拓寬動態(tài)范圍、提高M(jìn)S/MS碎裂特異性、發(fā)現(xiàn)新代謝物和標(biāo)志物等方面具有顯著優(yōu)勢。

關(guān)于醛的分析檢測進(jìn)展綜述,Berdyshev[20]在2011年評述了脂肪醛的GC-MS和LC-MS分析方法進(jìn)展,Jha等[21]在2017年、Laghrib等[22]在2019年分別評述了醛類傳感分析相關(guān)進(jìn)展,2019年Kishikawa等[23]綜述了生物/食品/環(huán)境樣品中醛的樣品前處理技術(shù)和基于色譜的分析方法進(jìn)展,Dator等[24]綜述了生物樣本中醛類的生物分析和質(zhì)譜分析方法?；瘜W(xué)衍生化聯(lián)合色譜-質(zhì)譜的分析策略是復(fù)雜體系中醛類精準(zhǔn)分析非常重要的解決方案之一,特別是近5年,基于化學(xué)衍生化的色譜-質(zhì)譜分析方法開發(fā)與應(yīng)用已成為醛類分析方法中的熱點和亮點。本文主要總結(jié)與評述了近5年來基于化學(xué)衍生化的GC-MS和LC-MS用于生物基質(zhì)(重點關(guān)注血液、尿液、唾液、腦脊液、生物組織等)中醛類標(biāo)志物的最新分析方法進(jìn)展。未見其他色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(包括毛細(xì)管電泳、超臨界流體色譜、微流控)用于醛類分析的工作,對于食品、水土氣等樣本以及醛類的傳感分析法、電化學(xué)法、熒光成像、常規(guī)色譜法(主要包括基于衍生化的HPLC-UV、HPLC-FLD、GC-FID 3類方法)也不再進(jìn)行評論。本文通過探討標(biāo)記小分子醛的各種衍生試劑、定性/定量分析方法及應(yīng)用價值,評述醛類暴露標(biāo)志物不同分析方法的優(yōu)缺點以及未來發(fā)展趨勢,為暴露組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)的整合發(fā)展和環(huán)境生態(tài)健康研究提供一定的幫助。

1 氣相色譜-質(zhì)譜法

GC-MS已廣泛用于醛類分析。對于揮發(fā)性醛,可以結(jié)合頂空(HS)萃取直接進(jìn)行GC分析,無需衍生化。然而,大量報道的方法是利用衍生化來改善醛的揮發(fā)性、穩(wěn)定性和電離效率[23]。與LC或LC-MS廣泛使用的2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生試劑不同,在GC或GC-MS醛類分析中,苯環(huán)上含有氯、氟的肼/胺類衍生試劑具有顯著優(yōu)勢。例如常用2,4,6-三氯苯肼(TCPH)、五氟苯肼(PFPH)、2,3,4,5,6-五氟苯羥胺(PFBHA)等衍生試劑,它們能夠更好地提高衍生物的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性,同時能夠生產(chǎn)更穩(wěn)定和特異的檢測離子。2016年,Serrano等[25]報道了一種基于PFBHA衍生化的HS-GC-MS分析方法,實現(xiàn)了人尿液中12種內(nèi)源性醛類的定性和定量測定,可用于吸煙人群或糖尿病患者醛類標(biāo)志物監(jiān)測。2019年,Wei等[26]采用PFBHA衍生化法建立了人類血液中7種小分子醛類代謝物(C1～C7)的HS-GC-MS分析方法。對膀胱癌患者(n=15)和正常人群組(n=15)的測定和統(tǒng)計分析(T檢驗)結(jié)果表明,7種脂肪醛含量在兩組之間均具有顯著差異,而且其中6種脂肪醛在膀胱癌患者血液中的含量極顯著性升高(P<0.001,丁醛除外)。小分子醛類代謝物具有生物標(biāo)志物的巨大潛力,衍生化技術(shù)能夠顯著改善GC-MS檢測的靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度等,在標(biāo)志物篩選、疾病篩查以及臨床研究等方面具有良好的科學(xué)價值。

近期,Semerad等[9]采用PFBHA衍生化HS-SPME-GC-MS分析方法,監(jiān)測細(xì)菌、真菌和藻類培養(yǎng)基受到納米零價鐵暴露損傷產(chǎn)生的醛類標(biāo)志物,結(jié)果表明能夠檢測到微生物活體體系產(chǎn)生的6種醛類化合物(甲醛、丙烯醛、甲硫基丙醛、苯甲醛、乙二醛和甲基乙二醛),并且6種醛含量均顯示出與納米污染物劑量的相關(guān)性。該文作者認(rèn)為這可能是第一篇研究微生物暴露于鐵納米顆粒后的氧化應(yīng)激狀態(tài)產(chǎn)生醛類標(biāo)志物的文獻(xiàn)[9]。

2 液相色譜-質(zhì)譜法

2.1 常規(guī)衍生化LC-MS/MS分析

具有串聯(lián)質(zhì)譜功能的LC-MS/MS已成為LC-MS分析的主流,這是因為MS/MS中多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式的檢測特異性得到了顯著提高,可減少干擾并提供快速、多通道分析。由于分析物的電離效率極大地影響了MS儀器靈敏度,因此在LC-MS/MS中,衍生化技術(shù)經(jīng)常用于提高醛的低電離效率。LC-MS的衍生化試劑通常具有較大的電子親和勢或者帶有分子內(nèi)正電荷。已報道的HPLC-UV和-FLD方法的衍生化試劑,由于其分子結(jié)構(gòu)具有易于電離的部分,大多可以用于LC-MS。DNPH是一種具有代表性的基于肼反應(yīng)基團(tuán)的衍生試劑,已廣泛應(yīng)用于多種醛的衍生化LC-MS分析。另外常常使用的衍生化試劑還包括:丹磺酰肼(DnsHz)、鄰苯二胺、D-半胱氨酸、9,10-菲醌(PQ)、3-硝基苯肼和3,4-二氨基二苯甲酮[23,24,27],限于本綜述在前言部分所述的綜述范圍,此處不再贅述。下面討論近5年具有一定代表性的工作。2015年,Fernandez-Molina等[28]采用DNPH作為衍生試劑,開發(fā)了一種將衍生化、固相微萃取(μ-SPE)與LC-MS聯(lián)合使用的快速、靈敏的分析策略,通過測定暴露人員尿液中脂肪族和芳香族低分子量醛類化合物含量(ng/L水平),可以獲得這些醛類化合物在暴露人員體內(nèi)的半衰期信息。馮鈺锜課題組[29]開發(fā)了一種基于磁性固相萃取結(jié)合DNPH原位衍生化的樣品前處理方法,用于測定肺癌患者尿液中的己醛和庚醛。2016年,Sobsey等[30]采用3-硝基苯肼為衍生試劑,開發(fā)了一種人類血漿中標(biāo)志物丙二醛的LC-MS/MS檢測方法,引入同位素標(biāo)記的13C6-3-硝基苯肼-丙二醛衍生物作為內(nèi)標(biāo),顯著提高了定量的靈敏度、準(zhǔn)確度、特異性,而且分析速度快(每樣2.5 min)。2021年,Yang等[31]采用3-三氟甲基嘧啶肼為衍生化試劑,開發(fā)了一種大鼠腦組織中一種毒性中間體代謝物3,4-二羥基苯乙醛的LC-MS/MS分析方法,通過控制生物樣品pH值和衍生化反應(yīng),生成了穩(wěn)定的衍生產(chǎn)物,該分析方法可用于不同狀態(tài)下活性醛的測定,對帕金森病等疾病相關(guān)研究具有重要意義。

圖 1 人甲狀腺組織中脂肪醛的季銨化增敏衍生與MS/MS特異性檢測[32]Fig. 1 Quaternization sensitizing derivatization of fatty aldehydes in human thyroid tissues and the MS/MS specific detection[32]

郭寅龍課題組[32]巧妙地設(shè)計衍生化反應(yīng),采用商品化的吡啶和亞硫酰氯對脂肪醛進(jìn)行季銨化衍生反應(yīng),如圖1所示。衍生產(chǎn)物具有很強(qiáng)的質(zhì)譜響應(yīng)和特異的子離子碎片,過量的吡啶對衍生產(chǎn)物的干擾相對較小,過量的亞硫酰氯通過加入去離子水即可除去。通過該檢測方法,在人類甲狀腺組織中檢測到了13種游離脂肪醛(C6～C18),其中長鏈脂肪醛(C10～C18)在甲狀腺癌組織中的濃度顯著高于癌旁組織中的濃度。更進(jìn)一步地,該課題組[33]將該衍生反應(yīng)的優(yōu)勢進(jìn)行拓展,實現(xiàn)了甲狀腺癌組織中脂肪醛、脂肪醇、甾醇的同時衍生和快速的離子淌度質(zhì)譜測定,具有快速簡便、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢。

醛類標(biāo)志物的柱后衍生化也是一種可行的解決方案[34]。近期,馮鈺锜課題組[35]采用亞硫酸銨作為柱后衍生試劑實現(xiàn)了醛類化合物的在線衍生和LC-MS/MS分析,具有快速簡便的顯著優(yōu)勢(見圖2)。衍生產(chǎn)物采用負(fù)離子模式檢測,在較低能量下的碰撞誘導(dǎo)解離即可產(chǎn)生特異的亞硫酸氫根產(chǎn)物離子,己醛和庚醛的檢出限分別為3 nmol/L和2 nmol/L,而且能夠?qū)崿F(xiàn)人類尿液或中草藥提取物中醛類的MRM定量測定和母離子掃描模式下的未知醛類篩選。

圖 2 醛的柱后衍生與MRM定量分析和母離子掃描非靶向篩選[35]Fig. 2 Post column derivatization and MRM quantitation of aldehydes and their non-targeted screening by precursor ion scan[35]

2.2 化學(xué)同位素標(biāo)記LC-MS/MS靶向分析

外標(biāo)定量法經(jīng)常受到質(zhì)譜儀信號波動的影響,往往導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。加入內(nèi)標(biāo)進(jìn)行輔助定量可以起到良好的校正效果。但內(nèi)標(biāo)的選擇往往是個難題,幾乎難以找到符合色譜分離、質(zhì)譜響應(yīng)定性/定量要求的內(nèi)標(biāo)化合物。同位素內(nèi)標(biāo)能夠解決上述問題,但是,常規(guī)實驗室難以合成符合要求的同位素內(nèi)標(biāo)物;而可以購買的同位素內(nèi)標(biāo)價格昂貴,并且很多分析物包括未知的代謝中間體、微量代謝產(chǎn)物等沒有商品化的同位素內(nèi)標(biāo)。通過合成高純的同位素標(biāo)記衍生試劑,對標(biāo)準(zhǔn)品或代謝組學(xué)混合樣品進(jìn)行衍生制取同位素內(nèi)標(biāo)物,可用于LC-MS的靶向定量測定、代謝差異分析、非靶向掃描等,是目前組學(xué)分析領(lǐng)域的一項前沿和關(guān)鍵技術(shù)[18,36-39]。

2016年,Tie等[40]采用輕/重同位素標(biāo)記衍生化技術(shù),建立了內(nèi)源性脂肪醛代謝物的LC-MS/MS靶向分析和掃描方法。采用H/D同位素取代的2,4-二(二乙氨基)-6-肼-1,3,5-三嗪為衍生試劑,大鼠血漿和腦組織中脂肪醛的衍生反應(yīng)在37 ℃下15 min內(nèi)完成,MRM定量檢出限在0.1～1 pg/mL;該策略應(yīng)用于頸側(cè)動脈癡呆大鼠模型與正常組大鼠的對比研究,發(fā)現(xiàn)兩組大鼠血漿和腦組織中分別有43種和19種脂肪醛含量發(fā)生顯著變化,這表明內(nèi)源性脂肪醛代謝物在活體動物生理病理研究中具有重要作用。

2018年,Kuroda研究組[41]在9,10-菲醌作衍生試劑的基礎(chǔ)上,通過14N/15N-乙酸銨引入同位素N原子,實現(xiàn)了醛類化合物的輕/重同位素標(biāo)記衍生化,從而建立了4-羥基-2-壬烯醛(HNE)和4-羥基-2-己烯醛(HHE)兩種醛類標(biāo)志物的LC-MS/MS靶向分析方法,該方法對人類血漿中的HNE和HHE的定量限分別達(dá)到了0.2 nmol/L和0.05 nmol/L。該方法通過血漿標(biāo)志物HNE和HHE檢測能夠區(qū)分正常人與糖尿病、風(fēng)濕病和心臟病患者。

圖 3 (a)14重LHMTs試劑的設(shè)計、合成以及(b)MTCIL的衍生化條件[42]Fig. 3 (a) Design and synthesis procedure of 14-plex LHMTs reagents and (b) MTCIL derivatization conditions[42]MTCIL: multiplex tags chemical isotope labeling.

2020年,我們研究組[42]設(shè)計、合成了一系列基于左氧氟沙星酰肼的質(zhì)量標(biāo)簽(LHMTs)試劑:LHMT359/360/361/362/363/364/365/366/373/375/376/378/379/381(見圖3),用于肺癌標(biāo)志物己醛和庚醛的高通量LC-MS/MS靶向分析。為了增加LHMTs試劑的通量,首先設(shè)計、合成氘代的D3-左氧氟沙星,然后對H3/D3-左氧氟沙星進(jìn)行簡單的同位素形態(tài)的烷基化、酰肼化簡單、高效的合成和純化,即可得到14種LHMTs衍生試劑。如圖4所示,LHMT359用于標(biāo)記己醛和庚醛混標(biāo),所得衍生產(chǎn)物作為LC-MS/MS MRM定量分析的內(nèi)標(biāo);LHMT373-庚醛衍生物用作虛擬模板,設(shè)計、制備了一種磁性分子印跡聚合物,可用于12重(12-plex)實際血清樣品標(biāo)記溶液與LHMT359內(nèi)標(biāo)溶液的混合液的磁性分散固相萃取,實現(xiàn)混合液中所有LHMTs-己醛/庚醛衍生物的同時、高選擇性、高通量富集與凈化。這種以質(zhì)量差異標(biāo)簽為虛擬模板設(shè)計、制備的虛擬模板分子印跡聚合物既保留了分子印跡材料的獨(dú)特選擇性,又避免了長期以來困擾分子印跡材料樣品前處理中模板泄露會導(dǎo)致定量不準(zhǔn)的技術(shù)難題。一次UHPLC-MS/MS進(jìn)樣分析(2 min)即可實現(xiàn)12個血清樣品的同時定量檢測,己醛和庚醛的檢出限為0.5 pmol/L。對肺癌患者、吸煙者和正常對照組血清檢測結(jié)果表明,肺癌患者血清中己醛與庚醛的濃度顯著高于正常人和吸煙者含量,因此,己醛和庚醛具有成為肺癌疾病標(biāo)志物的巨大潛力。多標(biāo)簽化學(xué)同位素標(biāo)記(MTCIL)技術(shù)是LC-MS/MS分析領(lǐng)域興起的一種兼具高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高選擇性的新策略,具有巨大優(yōu)勢和發(fā)展前景。在輕/重同位素標(biāo)記LC-MS/MS定量分析的基礎(chǔ)上,該技術(shù)顯著提高了分析通量,更大程度發(fā)揮了MRM多通道的獨(dú)特優(yōu)勢,將來在高通量定量和相對定量方面必將顯現(xiàn)出更大優(yōu)勢。

圖 4 多標(biāo)簽化學(xué)同位素標(biāo)記分析策略流程及其14種LHMTs質(zhì)量標(biāo)簽作用[42]Fig. 4 Analytic strategy workflow of multiplex tags chemical isotope labeling and the application of 14 LHMTs reagents[42]MDSPE: magnetic dispersive solid phase extraction.

2.3 化學(xué)同位素標(biāo)記LC-MS非靶向掃描與相對定量

常規(guī)衍生化或化學(xué)同位素標(biāo)記技術(shù)為LC-MS/MS定量分析提供了出色的靈敏度和良好的特異性,但缺乏篩選未知醛的能力。組學(xué)分析面臨從大量生物樣本中進(jìn)行非靶向掃描、篩選生物標(biāo)志物的巨大需求。化學(xué)同位素標(biāo)記技術(shù)聯(lián)合LC-MS的多種掃描模式(MRM、中性丟失掃描、母離子掃描、子離子掃描、全掃描等),能夠?qū)⒑Ａ康臉悠贩治鑫锓殖婶驶?、羧基、羥基、氨基等亞組,顯著提高非靶向掃描的靈敏度、覆蓋度、準(zhǔn)確度等,是組學(xué)分析中的前沿?zé)狳c[37]。

馮鈺锜課題組[43]開發(fā)了一種基于輕/重同位素標(biāo)記聯(lián)合液相色譜-雙中性丟失質(zhì)譜掃描的非靶向醛類化合物掃描方法,設(shè)計、合成了一對輕/重穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑:D0/D4-4-(2-(三甲銨基)乙氧基)-苯胺溴鎓(4-APC-d0/d4),分別用于標(biāo)記實際樣品和合并的對照樣品;在質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離作用下,4-APC-d0標(biāo)記和4-APC-d4標(biāo)記的羰基化合物分別產(chǎn)生質(zhì)量數(shù)為87 Da和91 Da的中性丟失碎片,從而通過雙中性丟失掃描得到人尿液和白葡萄酒中16種和19種醛類化合物;進(jìn)一步通過與合成標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較,確定了人尿中的5種和白葡萄酒中的4種醛類化合物。另外,他們[44]還開發(fā)了一種基于輕/重同位素標(biāo)記和液相色譜-雙母離子掃描質(zhì)譜分析(IL-LC-DPIS-MS)策略,用于人血清中的羰基化合物鑒定和相對定量;合成了含有碳酰肼的4種不同衍生試劑,并優(yōu)化選擇了一對輕/重同位素標(biāo)記試劑(2-(2-肼-2-羰乙基)異喹啉溴鎓(d0/d7-HIQB,見圖5),分別用于標(biāo)記實際血清樣品和合并對照血清樣品?；赿0/d7-HIQB羰基衍生物在母離子掃描模式下分別產(chǎn)生特征產(chǎn)物離子m/z130.1/137.1,建立了IL-LC-DPIS-MS策略,并用于掃描鑒定人血清中潛在羰基代謝物和已知羰基代謝物的相對定量分析(見圖6)。該研究總共在人血清中檢測到156種候選羰基化合物(重要醛類包括:丁烯醛、異戊醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛),其中12種通過合成標(biāo)準(zhǔn)品得到了進(jìn)一步鑒定。與健康對照組相比,骨髓性白血病患者中有44個羰基代謝物存在統(tǒng)計學(xué)差異。

圖 5 (a)4種標(biāo)記試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)和(b)d0/d7-HIQB對羰基化合物的標(biāo)記[44]Fig. 5 (a) Structures of the four labeling reagents and (b) labeling of carbonyl compounds by HIQB and d7-HIQB[44] HIQB: (2-(2-hydrazinyl-2-oxoethyl)isoquinolin-2-ium bromide; THB: N,N,N-triethyl-2-hydrazinyl-2-oxoethanaminium bromide; GT: Girard reagent T; GP: Girard reagent P.

圖 6 LC-DPIS-MS策略用于羰基化合物輪廓分析[44]Fig. 6 Schematic diagram for profiling of carbonyl compounds by LC-DPIS-MS[44]CID: collision-induced dissociation; DPIS: double precursor ion scan.

加拿大Li教授課題組[45]開展了一系列創(chuàng)新性的基于化學(xué)同位素標(biāo)記的代謝組學(xué)研究工作,在羰基化合物代謝亞組的分析表征方面開發(fā)了一種高效的基于化學(xué)同位素標(biāo)記的LC-MS代謝組學(xué)解決方案(CIL-LC-MS)。該解決方案以其合成的輕/重同位素標(biāo)記試劑12C/13C-丹磺酰肼(12C/13C-DnsHz)為標(biāo)記試劑,分別用于標(biāo)記單個尿樣和合并對照尿樣,再采用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(LC-QTOF-MS)羰基化合物鑒定和相對定量(見圖7);開發(fā)了用于處理CIL-LC-MS質(zhì)譜數(shù)據(jù)的內(nèi)部軟件程序,并構(gòu)建了基于DnsHz標(biāo)記物的數(shù)據(jù)庫(www.mycompoundid.org)從而更方便地鑒定羰基代謝物。該研究總共在人類尿液中檢測到1 737個峰對,其中33個得到了確認(rèn)。這些結(jié)果表明,12C/13C-DnsHz標(biāo)記CIL-LC-MS方案是一種能夠高覆蓋率分析復(fù)雜樣品羰基亞代謝組的有效解決手段。該課題組[46]進(jìn)一步提高了代謝組覆蓋率,通過對4個亞組的代謝物羥基、胺和酚、羧基、羰基分別進(jìn)行同位素標(biāo)記和LC-MS分析,在人類血漿和酵母菌中都發(fā)現(xiàn)了高覆蓋度的峰對,這對代謝組的分析方法發(fā)展和應(yīng)用提供了良好的解決方案。

圖 7 12C/13C-DnsHz標(biāo)記CIL-LC-MS羰基代謝亞組相對定量分析流程[45]Fig. 7 Workflow of 12C-/13C-dansylhydrazine labeling for relative quantification of the carbonyl submetabolome differences in comparative samples by CIL-LC-MS[45] CIL: chemical isotope labeling.

2.4 衍生化液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析

液相色譜-高分辨質(zhì)譜(LC-HRMS)已成為LC-MS分析領(lǐng)域未來重要發(fā)展方向?；诟叻直媛寿|(zhì)譜的代謝組學(xué)分析方法可提供母離子和MS/MS碎片離子的準(zhǔn)確質(zhì)量,因此可以可靠地鑒定復(fù)雜生物基質(zhì)中檢測到的代謝物。最近,Balbo課題組[47]開發(fā)了一種基于高分辨質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)MS3中性丟失掃描策略,以表征生物樣本中DNPH衍生的羰基化合物,從而實現(xiàn)了同時檢測和定量可疑和未知的羰基化合物。以前對DNPH羰基化合物衍生物的分析大多以負(fù)離子模式和相對較高的流速下進(jìn)行,這限制了痕量分析物檢測和定量的靈敏度。在正離子模式下,這些化合物在碰撞誘導(dǎo)解離后顯示出特征性的羥基自由基(·OH)中性丟失。在負(fù)離子模式下未觀察到這種中性丟失現(xiàn)象。因此,DNPH羰基化合物衍生物的特征性·OH中性丟失被用作MS數(shù)據(jù)采集掃描方法,從而可以更準(zhǔn)確鑒定羰基化合物(見圖8)。此外,通過使用D0/D3-DNPH輕/重同位素標(biāo)記的相對定量策略,測定乙醇暴露后羰基化合物的相對含量。將暴露前的樣品用D0-DNPH標(biāo)記,而暴露后的樣品用D3-DNPH標(biāo)記,兩種標(biāo)記樣品以1∶1(v/v)的比例混合,采用上述建立的方法進(jìn)行分析。該分析流程提供了一種更加準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)健的方法,可以鑒定和定量各種生物基質(zhì)中的毒性羰基化合物,以進(jìn)行暴露風(fēng)險評估。這與以前報道的工作形成鮮明對比,之前的工作使用了相對較高的流速(0.2～1.5 mL/min)和低分辨率MS分析,從而限制了它們在痕量分析物水平上的靈敏度和鑒定可信度。Balbo課題組[47]應(yīng)用新開發(fā)的方法來表征人類飲酒后唾液中羰基化合物的變化水平,結(jié)果表明乙醛水平在暴露后會增加。該策略亦可用于表征電子煙使用以及吸煙相關(guān)的羰基化合物暴露評估。

圖 8 高分辨精確質(zhì)量數(shù)MS3中性丟失掃描策略[47]Fig. 8 High resolution accurate mass data-dependent MS3 neutral loss screening strategy[47] The high resolution accurate mass of ·OH (17.0027 Da) was used to screen for all 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)-derivatized carbonyls. In addition, monitoring specific fragment ions (m/z 78.0332 and 164.0323) minimize possible false positive identification.

3 結(jié)論與展望

總體而言,色譜-質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合是強(qiáng)大的分離分析工具,可用于篩查鑒定和定量測定各種生物基質(zhì)中的醛類化合物。這些分析方法的高選擇性和特異性聯(lián)合從MS和MSn質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲得的結(jié)構(gòu)信息是鑒定和定量已知和未知化合物的理想手段。本文介紹的基于色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的醛類分析方法為復(fù)雜生物基質(zhì)中醛類的檢測提供了更高的靈敏度、選擇性和特異性。盡管這些技術(shù)非常靈敏,但它們也容易受到基質(zhì)干擾的影響,需要嚴(yán)格的樣品凈化處理。另外,這些技術(shù)需要昂貴的儀器和訓(xùn)練有素的操作人員,并且便攜性較差?；谫|(zhì)譜的新技術(shù)的開發(fā)正在不斷向新的應(yīng)用發(fā)展,特別是適合人體暴露評估的痕量分析,以此闡明它們對人類健康的貢獻(xiàn)和影響。

醛是暴露組的主要成分,往往是在多種醛類痕量水平上,并且在某些情況下是由于內(nèi)源性和外源性聯(lián)合產(chǎn)生的。醛在包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)理中占據(jù)重要位置。由于它們的反應(yīng)性以及多

種化合物的共存性,對醛類化合物進(jìn)行分析和表征特別困難。為了闡明這些外源性和內(nèi)源性醛類化合物在生理和病理事件中所起的復(fù)雜作用,需要大力改進(jìn)研究醛組學(xué)的分析表征技術(shù)和工具。隨著更先進(jìn)的質(zhì)譜儀的研發(fā)和使用,以及高效色譜分離和不斷進(jìn)步的生物信息學(xué)手段,并同時伴隨著單細(xì)胞分析、質(zhì)譜成像的興起,未來的醛類暴露組分析方法會具有更高的靈敏度、更高的分析通量,更有希望篩選鑒定未知醛類化合物并發(fā)現(xiàn)新的暴露組生物標(biāo)志物。