柴佩君, 宋志花*, 劉萬卉, 薛俊萍, 王 碩, 劉金秋, 李金花

(1. 煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院, 新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心, 分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 煙臺(tái) 264005; 2. 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東省海岸帶環(huán)境過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 煙臺(tái) 264003; 3. 中國(煙臺(tái))知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)中心, 山東 煙臺(tái) 264003)

抗生素是由微生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的或是由人工或半人工合成的一種有機(jī)物[1],主要包括:磺胺類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類等[2]?？股貙?duì)微生物的活性有抑制作用[3],可使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性而減弱治療效果[4],其濫用會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大危害[5],且難以通過水凈化過程去除[6]。世界衛(wèi)生組織認(rèn)為,抗生素的耐藥性是一場全球的公共危機(jī),需要人們嚴(yán)肅對(duì)待[7]。因此,建立新的檢測(cè)方法以檢測(cè)抗生素的含量,對(duì)于管控抗生素污染至關(guān)重要[8]。常見的檢測(cè)方法包括:高效液相色譜法[9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、酶聯(lián)免疫檢測(cè)法[12]等。為了進(jìn)一步降低檢出限,人們發(fā)展了一系列新型材料以輔助上述檢測(cè)過程,如:分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)[13,14]、分析物響應(yīng)水凝膠[15]、有機(jī)骨架[16]、碳點(diǎn)(carbon dots, CDs)[17]等。其中,CDs因優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)而成為研究熱點(diǎn)。

CDs又名碳量子點(diǎn),是一種零基納米材料,包括碳納米點(diǎn)(carbon nano dots, CNDs)、石墨烯量子點(diǎn)(graphene quantum dots, GQDs)和聚合物點(diǎn)(polymer dots, PDs)[18,19],其制備分為“自上而下”和“自下而上”兩種方法[20]。CDs因具有良好的水溶性、生物相容性、獨(dú)特的光學(xué)和電學(xué)特性、來源廣泛易得等優(yōu)點(diǎn)[21,22],已被用于檢測(cè)環(huán)境中的金屬離子[23,24]。最近,人們將CDs與傳感分析[25]、新型色譜固定相制備等技術(shù)結(jié)合,以有效檢測(cè)抗生素。本文對(duì)近幾年CDs在抗生素分析檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié),對(duì)所涉及的方法進(jìn)行了歸納,并對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行了展望,以期望新型CDs材料為解決復(fù)雜環(huán)境樣品中的抗生素提供新的契機(jī)。

1 CDs與傳感技術(shù)結(jié)合檢測(cè)抗生素

傳感器具有高選擇性、高靈敏度等性能,能夠?qū)崿F(xiàn)物質(zhì)的快速檢測(cè),被廣泛應(yīng)用于抗生素的測(cè)定[26,27]。CDs的量子限制和邊緣效應(yīng)[28,29]使其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)電子的運(yùn)輸和導(dǎo)電,可有效提高傳感器的信噪比[30,31]。目前,與CDs結(jié)合檢測(cè)抗生素的傳感器主要包括生物傳感器、光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器等。

1.1 生物傳感器

1.1.1分子印跡傳感器

分子印跡技術(shù)是一種新型的模板導(dǎo)向技術(shù),該技術(shù)合成的MIPs對(duì)某一種或某一類分析物具有特異性識(shí)別作用[32],可用作傳感器中識(shí)別元件的替代材料[33]。將CDs與MIPs相結(jié)合,可有效增強(qiáng)CDs的熒光效應(yīng)[34],基于MIPs的傳感器備受科研工作者青睞[35]。

Liu等[36]以甘薯皮為原料,以土霉素(oxytetracycline, OTC)為模板分子,制備了MIPs包覆的CDs,將其作為熒光探針用于檢測(cè)蜂蜜中的OTC,檢出限為15.3 ng/mL,且該探針可以重復(fù)使用5次以上,大大降低了檢測(cè)成本。證實(shí)了MIPs可以提高CDs對(duì)OTC檢測(cè)的選擇性,這種基于MIPs涂層制備CDs的方法對(duì)蜂蜜中OTC的含量測(cè)定是可行的。在MIPs提高特異選擇性的基礎(chǔ)上,研究人員為了降低外界環(huán)境的干擾,進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度,設(shè)計(jì)了比率熒光傳感器。比率熒光傳感器是通過測(cè)量兩種或兩種以上波長的熒光強(qiáng)度比來分析目標(biāo)物[37,38],其內(nèi)部的探針具有校正功能,能有效降低檢出限。并且該探針的熒光信號(hào)可視性強(qiáng),極大地降低了成本,具有很高的應(yīng)用價(jià)值[39]。

圖 1 (a)碳點(diǎn)的制備和(b)比率傳感器的制備及青霉素傳感機(jī)理示意圖[33]Fig. 1 (a) Synthesis of carbon dots (CDs) and (b) schematic of the preparation of ratiometric sensor and the sensing mechanism of penicillin[33]TEOS: tetraethoxysilane; APTES: 3-aminopropyltriethoxysilane; CTAB: cetyltrimethylammonium bromide; PNG: penicillin.

Chen等[40]以磺胺嘧啶(sulfadiazine, SDZ,由抗生素濫用引起的一種環(huán)境污染物)為模板分子,設(shè)計(jì)了一種比率熒光納米傳感器,用于SDZ的檢測(cè),標(biāo)準(zhǔn)樣品中SDZ的檢出限為0.042 μmol/L。且該傳感器可對(duì)自來水樣品中的SDZ進(jìn)行檢測(cè),回收率可達(dá)91.7%～101.2%。隨著樣品濃度的變化,具有不同顏色的CDs可產(chǎn)生不同程度的熒光淬滅,通過比較加入樣品前后的熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的檢測(cè)。與單發(fā)射的熒光傳感器相比,比率熒光傳感器可有效避免單熒光傳感器引起的誤差,減弱檢測(cè)條件的干擾。Liu等[41]構(gòu)建了分子印跡比率傳感器(MIPs@rCDs/bCDs@SiO2),在0～50 nmol/L的線性范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)樣品中四環(huán)素(tetracycline, TC)的檢出限為1.19 nmol/L,且已被證實(shí)對(duì)來自河水、自來水中等實(shí)際樣中的TC能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。雖然這是一種高選擇性的體系,但CDs作為熒光淬滅的信號(hào)輸出,易受到儀器和環(huán)境的影響,重現(xiàn)性有待提高。比率傳感器除對(duì)環(huán)境等復(fù)雜樣品有很好的檢測(cè)外,還可以對(duì)牛奶等含有痕量抗生素的樣品實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測(cè)。Jalili等[33]報(bào)道了雙熒光團(tuán)比率熒光傳感器(見圖1),該傳感器的響應(yīng)時(shí)間約為5 min,為非印跡傳感器響應(yīng)時(shí)長的1/8,其對(duì)牛奶中青霉素(penicillin, PNG)的檢出限為0.34 nmol/L。該方法具有快速、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[42]。該課題組[43]還將該類傳感器用于標(biāo)準(zhǔn)樣品中氯霉素(chloramphenicol, CAP)的檢測(cè),線性響應(yīng)范圍為0.1～3 μg/L,檢出限為0.035 μg/L。Sahebi等[44]采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)對(duì)牛奶中的PNG等5種抗生素進(jìn)行分析,其檢出限為0.03～0.20 μg/kg;此外,崔敬鑫等[45]采用UHPLC-MS/MS對(duì)水樣中氯霉素類、四環(huán)素類等15種抗生素同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,其檢出限為2.1～22.0 ng/L。由此可見,基于MIPs的比率傳感器,其檢出限與UHPLC-MS/MS的檢出限可達(dá)到相同的數(shù)量級(jí),且比率傳感器無需昂貴的生物識(shí)別分子或復(fù)雜的傳感系統(tǒng),具有強(qiáng)大的可視化效果,易于攜帶,可用于現(xiàn)場檢測(cè)。

1.1.2適配體傳感器

適配體是由20～60個(gè)核苷酸組成的單鏈DNA或RNA分子[46],類似于抗體,適配體具有易于標(biāo)記、合成簡單以及與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合能力好的優(yōu)點(diǎn),被廣泛用作傳感器的識(shí)別元件[47,48]。

Wang等[49]用枸櫞酸包被的金納米粒子(AuNPs)作為吸收劑,構(gòu)建了一種新型無標(biāo)記的適配體傳感器來檢測(cè)食品中的卡那霉素。該傳感器基于內(nèi)濾效應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中卡那霉素檢測(cè)的線性范圍為0.04～0.24 μmol/L,檢出限為18 nmol/L,對(duì)牛奶樣品中卡那霉素檢測(cè)時(shí),回收率可達(dá)到98%?；趦?nèi)濾效應(yīng)的檢測(cè)方法不需要CDs與AuNPs相連接,僅需要AuNPs的吸收光譜與CDs的熒光激發(fā)光譜有重疊即可,有效簡化了實(shí)驗(yàn)步驟,實(shí)用性強(qiáng);且用枸櫞酸修飾的AuNPs提高了熒光淬滅效率,結(jié)合適配體的特異性識(shí)別,能達(dá)到滿意的檢測(cè)效果。但這種基于原子吸收光譜分析的適配體傳感器存在熒光團(tuán)使用壽命短、易受背景熒光及環(huán)境影響的問題。Roushani等[50]開發(fā)了基于AuNPs和巰基石墨烯量子點(diǎn)(GQD-SH)的傳感器,用于檢測(cè)牛奶和血清中的鏈霉素(streptomycin, STR)。在此基礎(chǔ)上,該課題組[51]又提出了基于胺基和巰基功能化的GQDs-N-S的新型核酸適體傳感器,將銀納米粒子(AgNPs)包覆在玻碳電極(GCE)上以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的STR,其檢出限為0.003 3 pg/mL,對(duì)血清中的STR檢測(cè)時(shí),回收率高達(dá)99.03%。此外,Roushani等[52]還通過將硫脲包覆的ZnS量子點(diǎn)和AuNPs包覆于GCE表面,建立了一種硫醇適配體修飾的傳感系統(tǒng),用以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的STR,其檢出限為0.35 fg/mL,極大提高了檢測(cè)靈敏度,并證實(shí)可對(duì)實(shí)際樣品中血清等生物樣品中的STR進(jìn)行檢測(cè)。這種基于電化學(xué)阻抗譜方法制備的傳感器具有較高的選擇性,良好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性,對(duì)解決環(huán)境等復(fù)雜實(shí)際樣品中抗生素的檢測(cè)難題具有潛在應(yīng)用價(jià)值,但構(gòu)建該類傳感器過程復(fù)雜,成本高,因此發(fā)展新型材料對(duì)該領(lǐng)域十分必要。

MIPs具有與模板分子在形狀、大小、官能團(tuán)互補(bǔ)且完全匹配的結(jié)合位點(diǎn),其獨(dú)特的識(shí)別能力以及極高的物理穩(wěn)定性使其成為生物傳感器識(shí)別元件的不二選擇;相比于傳統(tǒng)的識(shí)別元件(抗體等),適配體易于合成,穩(wěn)定性強(qiáng),價(jià)格便宜,且適配體序列具有很強(qiáng)的靈活性,易于標(biāo)記和修飾,被認(rèn)為是最有希望的替代元件。將CDs與MIPs及適配體相結(jié)合,有望提高傳感器的檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。相比于適配體傳感器,MIPs傳感器具有更強(qiáng)的機(jī)械穩(wěn)定性,但其與目標(biāo)物的結(jié)合能力稍差[53,54],在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)目標(biāo)分子的特點(diǎn)進(jìn)行選擇。例如,Geng等[55]在以卡那霉素為模板分子、硒化鎘(CdSe)量子點(diǎn)為載體、甲基丙烯酸為功能單體的基礎(chǔ)上,加入了經(jīng)巰基修飾的適配體作為另一種功能單體,使合成的傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)卡那霉素的高靈敏檢測(cè)。在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)樣品中卡那霉素的檢出限為0.013 μg/mL,在對(duì)來自湖水、自來水中的卡那霉素進(jìn)行檢測(cè)時(shí),均可得到滿意的結(jié)果。將適配體和MIPs的印跡空穴相結(jié)合,能實(shí)現(xiàn)對(duì)分析物的雙重識(shí)別,提高檢測(cè)靈敏度;此外,量子點(diǎn)表面的活性基團(tuán)有利于在其表面形成MIPs層。將MIPs及適配體與傳感器相結(jié)合,使檢測(cè)效果更加顯著,這種策略是檢測(cè)復(fù)雜環(huán)境樣品中抗生素的有效方法。另外,Roushani等[54]將適配體傳感技術(shù)與分子印跡技術(shù)結(jié)合,增強(qiáng)了傳感性能,標(biāo)準(zhǔn)樣品中CAP的檢出限為0.3 pmol/L,對(duì)實(shí)際樣品牛奶中CAP的回收率可達(dá)103%。

1.2 光學(xué)傳感器

光學(xué)傳感器因具有操作簡單、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì),成為抗生素檢測(cè)方法的研究熱點(diǎn)[56]。按照檢測(cè)方法的差異,光學(xué)傳感器可分為化學(xué)發(fā)光法、熒光法等,這兩種方法在抗生素檢測(cè)中最常用[57]?；诹孔狱c(diǎn)的光學(xué)傳感器因具有寬吸收光譜和窄發(fā)射光譜,備受研究者關(guān)注。

1.2.1電化學(xué)發(fā)光傳感器

電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence, ECL)是一個(gè)將電化學(xué)和光譜學(xué)結(jié)合的技術(shù),當(dāng)電極發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)達(dá)到激發(fā)態(tài)時(shí),電極上生成的物質(zhì)就會(huì)發(fā)光[58]。這使得ECL不需要借助外部光源,具有快速響應(yīng)、背景噪音低的優(yōu)點(diǎn)[59,60]。CDs可有效提高電極的電化學(xué)活性[61],將CDs引入ECL傳感器,大大提高了檢測(cè)靈敏度。

1.2.2熒光傳感器

熒光檢測(cè)具有響應(yīng)速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),常用來檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中的抗生素。CDs因具有獨(dú)特的熒光特性、良好的生物相容性[65],常被作為熒光探針來分析目標(biāo)物,是熒光檢測(cè)的優(yōu)良材料。Yu等[66]以賴氨酸為原料,采用微波法合成了CDs,并將其用于抗生素類化合物的檢測(cè)。TC、多西環(huán)素(doxycycline, DOX)等7種抗生素在290 nm和365 nm的光激發(fā)下,對(duì)CDs表現(xiàn)出不同的熒光猝滅現(xiàn)象。此外,將Al3+離子與CDs進(jìn)行絡(luò)合后,不僅可改變其熒光強(qiáng)度[67],還會(huì)使7種抗生素的發(fā)射峰有所差異,由此,可根據(jù)峰位置和熒光強(qiáng)度的變化對(duì)7種抗生素進(jìn)行定性分析(見圖2),其對(duì)各種標(biāo)準(zhǔn)樣品中抗生素的檢出限均低于50 nmol/L。該方法證明,CDs是基于內(nèi)濾效應(yīng)以及靜態(tài)淬滅效應(yīng)來檢測(cè)抗生素,為人們研究利用CDs檢測(cè)抗生素提供了理論依據(jù)，開辟了新思路。為了增強(qiáng)CDs的熒光性能,研究人員[68]通過其他原子的摻雜來提高檢測(cè)能力。Chen等[69]開發(fā)了一種N、B、F共摻雜碳點(diǎn)(N,B,F-CDs),并將其用于標(biāo)準(zhǔn)樣品中磺胺噻唑(sulfathiazole, STZ)的檢測(cè),其檢出限為5.5 ng/mL。將該傳感器對(duì)來自土壤、河水中的STZ進(jìn)行檢測(cè),其回收率為96.7%～101.0%,該制備方法簡單、靈敏,環(huán)境友好,對(duì)環(huán)境樣品中STZ的檢測(cè)具有巨大的應(yīng)用價(jià)值,但該方法需要對(duì)樣品進(jìn)行繁雜的前處理,無法直接對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行現(xiàn)場檢測(cè)。除了基于內(nèi)濾效應(yīng)和靜態(tài)淬滅效應(yīng)檢測(cè)抗生素外,Fu等[70]首次提出了基于共振能量轉(zhuǎn)移(F?rster resonance energy transfer, FRET)機(jī)理的CDs熒光探針檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品中OTC,其檢出限為0.41 μmol/L,并對(duì)河水、自來水及礦泉水中的OTC進(jìn)行測(cè)定,其回收率為95.0%～105.0%,該方法無需引入其他熒光基團(tuán),改善了探針的重復(fù)性,為實(shí)現(xiàn)抗生素的高靈敏檢測(cè)提供了一種新思路。基于CDs的熒光探針的優(yōu)點(diǎn)包括:所用試劑價(jià)格便宜、選擇性高、靈敏度高。CDs優(yōu)異的熒光特質(zhì)提高了熒光傳感器的傳感性能,但對(duì)抗生素的分離能力有限,因此發(fā)展選擇性強(qiáng)的CDs材料以及與各種新型材料、傳感技術(shù)、檢測(cè)方法相結(jié)合對(duì)于環(huán)境中抗生素的檢測(cè)具有重要意義。

圖 2 7種抗生素的兩步檢測(cè)流程圖[66]Fig. 2 Flow chart of two-step detection for seven kinds of antibiotics[66] MTR: metronidazole; DOX: doxycycline; TCY: tetracycline; CTE: chlortetracycline; OXY: oxytetracycline; CHL: chloramphenicol; SDI: sulfadiazine.

為了使檢測(cè)結(jié)果更加直觀、準(zhǔn)確,人們開發(fā)了比色以及比率傳感的方法。Miao等[71]以煙草為原料合成CDs,將其作為熒光探針,用于3種抗生素標(biāo)準(zhǔn)樣品TC、金霉素(aureomycin, CTC)、OTC的檢測(cè),檢出限分別為5.18、6.06、14 nmol/L。此外,Miao等[71]將含有CDs的液滴浸潤待測(cè)物,再采用紫外燈照射,根據(jù)顏色變化對(duì)3種抗生素進(jìn)行檢測(cè)。該方法具有簡單、易操作、結(jié)果明顯的特點(diǎn),可作為熒光探針用于環(huán)境污染物的痕量檢測(cè)。Hu等[72]通過將藍(lán)色CDs與單磷酸胞苷(CMP)/銪配位聚合物納米粒子結(jié)合,設(shè)計(jì)了一種比率熒光傳感器的探針BCDs-Eu/CMP-cit,并將其用于TC的檢測(cè)。該方法具有雙信號(hào)響應(yīng)性,在檢測(cè)牛奶等實(shí)際樣品時(shí),所得回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等參數(shù)與高效液相色譜法的檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。同時(shí),將含有BCDs-Eu/CMP-cit探針的濾紙條用來檢測(cè)牛奶、蜂蜜、牛肉中的TC,當(dāng)樣品中TC濃度高于0.05 μmol/L時(shí),用肉眼可直接觀察到濾紙條的顏色隨TC濃度改變而發(fā)生變化,該方法具有巨大的實(shí)際應(yīng)用潛力。在熒光檢測(cè)的基礎(chǔ)上,借助比色和比率的研究方法,使得檢測(cè)結(jié)果更加清晰、準(zhǔn)確。CDs與不同的抗生素結(jié)合可在不同的波長下呈現(xiàn)出不同的顏色,比色法的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯、操作簡單、無需借助其他復(fù)雜儀器就可得到最直觀的結(jié)果,但其抗干擾能力較弱,易受環(huán)境影響;而比率熒光探針通過兩個(gè)熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值來檢測(cè)分析物,克服了單個(gè)熒光探針產(chǎn)生的誤差,有效提高了準(zhǔn)確度。兩種策略在保障低檢出限的基礎(chǔ)上,對(duì)檢測(cè)結(jié)果的直觀性、準(zhǔn)確性有了進(jìn)一步的提高,擴(kuò)寬了熒光傳感器的應(yīng)用。

圖 3 抗生素識(shí)別原理及結(jié)果分析圖[76]Fig. 3 Antibiotic identification principle and result analysis charts[76] a. schematic illustration of antibiotic recognition; b. fluorescence response of these four CDs against eight antibiotics; c. LDA plot with 95% confidence interval. TC: tetracycline; OTC: oxytetracycline; CTC: aureomycin; SPM: spiramycin; ERY: erythromycin; SM: streptomycin; CHL: chloramphenicol; NEO: neomycin.

在比率傳感器的基礎(chǔ)上,人們又提出了陣列型傳感器,該傳感器可同時(shí)對(duì)多種成分進(jìn)行檢測(cè),且無需極高的特異性受體[73],已被廣泛應(yīng)用于多種目標(biāo)物的測(cè)定[74,75]。Mao等[76]設(shè)計(jì)了一種交叉反應(yīng)傳感器陣列來檢測(cè)OTC、TC等8種標(biāo)準(zhǔn)樣品抗生素,用異亮氨酸(isoleucine, Iso)等4種氨基酸作為CDs的非特異性受體,該受體可與目標(biāo)分析物相互作用,采用凝膠生物成像系統(tǒng)對(duì)其熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行檢測(cè),產(chǎn)生特定的“指紋”圖譜。當(dāng)加入4類(8種)抗生素時(shí),被修飾的CDs熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生變化,可對(duì)8種抗生素進(jìn)行測(cè)定。該傳感器的識(shí)別示意圖、熒光響應(yīng)、線性判別分析(linear discrimination analysis, LDA)分析圖見圖3。該工作可以在短時(shí)間(幾秒鐘)內(nèi)得到所有物質(zhì)的熒光變化譜圖,可對(duì)人尿液等復(fù)雜介質(zhì)中8種抗生素進(jìn)行檢測(cè)。Long等[77]設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記的四通道熒光陣列傳感器,用以檢測(cè)TC等4種抗生素標(biāo)準(zhǔn)樣品,以綠、藍(lán)色CDs以及它們的混合物作為傳感元件,能對(duì)濃度為1 μmol/L的4種抗生素實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒別,且對(duì)牛奶中的TCs具有很好的響應(yīng)。該方法不引入任何金屬離子和有害物質(zhì),也無需復(fù)雜的裝置,具有環(huán)境友好、操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。Xu等[78]開發(fā)了雙通道熒光傳感器陣列,可有效區(qū)分濃度為10 μmol/L的4種標(biāo)準(zhǔn)樣品抗生素(TC、OTC、美他環(huán)素(metacycline, MTC)、DOX),對(duì)河水和牛奶等實(shí)際樣品中的TCs進(jìn)行鑒定,準(zhǔn)確率高達(dá)100%。傳感器陣列對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的多種抗生素檢測(cè)具有分析時(shí)間短、靈敏度高、干擾小、準(zhǔn)確度高等一系列優(yōu)勢(shì),且對(duì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似的物質(zhì)也能進(jìn)行良好的區(qū)分檢測(cè)。結(jié)合CDs的陣列傳感器雖比其他檢測(cè)方法提供更多的信息,但存在數(shù)據(jù)處理和分析方法上的問題,仍需繼續(xù)改進(jìn)。如常用的主成分分析法(principle component analysis, PCA),常由于忽略內(nèi)部信息,而造成不必要的分類;LDA雖能解決這一問題,但在分析處理非線性數(shù)據(jù)時(shí)存在弊端;作為能處理線性和非線性數(shù)據(jù)的支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)已被證實(shí)可以用于傳感陣列檢測(cè)抗生素,但其也存在分類上的問題。因此,利用陣列傳感器檢測(cè)抗生素時(shí),在陣列傳感器構(gòu)建以及數(shù)據(jù)處理方面仍需進(jìn)一步改進(jìn),對(duì)提高抗生素檢測(cè)靈敏度有重大意義。

1.3 電化學(xué)傳感器

電化學(xué)方法因具有靈敏度高、便攜、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境友好的特點(diǎn),被應(yīng)用于環(huán)境污染物的檢測(cè)[79,80]。采用CDs修飾電極可增大其表面積,使其捕獲更多的分析物,CDs與電化學(xué)結(jié)合也成為該領(lǐng)域的新興發(fā)展趨勢(shì)[81]。

Huang等[82]采用電聚合法合成聚鄰氨基苯酚(PoAP)/GQD膜包覆的GCE,以提高傳感器對(duì)左氧氟沙星(levofloxacin, LV)的檢測(cè)能力。該儀器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中LV的檢出限為10 nmol/L,信噪比為3,與其他電化學(xué)材料(如MIP/G-Au/GCE)相比,具有更寬的檢測(cè)范圍,更低的檢出限,對(duì)牛奶中的LV測(cè)定時(shí),其回收率可達(dá)96.0%～101.0%。GQD具有很好的水溶性,可通過靜電力與LV結(jié)合,且與PoAP之間的π-π堆積作用使得GQD能吸附在GCE上,增強(qiáng)其導(dǎo)電性。為了增強(qiáng)GQD在GCE上的穩(wěn)定性,研究者還設(shè)計(jì)使用了其他的材料。如Gondim等[83]采用GQD@Nafion(Nafion即全氟磺酸隔膜,可被用作陽離子傳導(dǎo)膜和電子屏障,用于增強(qiáng)電極表面納米粒子的穩(wěn)定性[84])對(duì)玻璃碳電極進(jìn)行修飾,并用于測(cè)定牛奶中的磺胺類藥物,結(jié)果令人滿意。CDs具有良好的導(dǎo)電性,使得經(jīng)CDs修飾后的電極具有更高的選擇性。此外,人們還通過CDs與其他納米材料相結(jié)合的手段,進(jìn)一步降低抗生素的檢出限。Muthusankar等[85]合成了Co3O4包覆氮摻雜碳點(diǎn)負(fù)載于多壁碳納米管表面的復(fù)合材料(N-CQD@Co3O4/MWCNTs),以測(cè)定呋喃妥因(NF)。將該復(fù)合材料涂覆在GCE表面(N-CQD@Co3O4/MWCNT/GCE)使得電極和電解質(zhì)界面接觸充分,利于電荷轉(zhuǎn)移,標(biāo)準(zhǔn)樣品中NF的檢出限為0.044 μmol/L,有效提高了檢測(cè)靈敏度。該體系中載體多壁碳納米管具有較大的表面積,使得電子傳輸更迅速;N-CQDs與MWCNTs之間的疏水作用,增強(qiáng)了復(fù)合材料的穩(wěn)定性及電化學(xué)活性。

CDs能提高電化學(xué)傳感器的傳感性能,但CDs不能直接吸附在GCE上,這不利于電化學(xué)傳感器檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性,且會(huì)縮短傳感器的使用壽命。雖然,目前已有很多復(fù)合材料、載體輔助CDs修飾GCE,但仍需開拓更多的材料,協(xié)助CDs檢測(cè)更多種類的抗生素。此外,發(fā)展尺寸可控CDs的制備方法，并探索CDs對(duì)目標(biāo)分析物的響應(yīng)機(jī)理，將有利于進(jìn)一步改善CDs對(duì)抗生素檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2 CDs與色譜技術(shù)結(jié)合用于抗生素的檢測(cè)

色譜技術(shù)的發(fā)展主要依靠色譜固定相的制備技術(shù)和新的檢測(cè)手段,固定相作為色譜柱的核心[86],直接影響化合物的分離,為了有效改善抗生素類化合物分離結(jié)果的準(zhǔn)確性,人們發(fā)展了一系列新型色譜固定相。其中,CDs因其表面具有親疏水性基團(tuán)、尺寸小、在硅膠表面分布均勻等特性,可與多孔硅膠結(jié)合用作色譜固定相,用于抗生素類化合物的有效分離。

Yuan等[87]設(shè)計(jì)并合成了一種葡萄糖衍生的CDs,用于修飾多孔硅膠微球(Sil-Glc-CDs),可對(duì)氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、羅紅霉素等6種抗生素標(biāo)準(zhǔn)樣品實(shí)現(xiàn)完全分離,且對(duì)羅紅霉素的分離柱效高達(dá)63 000 N/m,與非摻雜CDs的色譜柱(Sil-Glc柱)相比,具有更好的色譜分離性能。CDs作為固定相的修飾材料,不僅具有豐富的反應(yīng)位點(diǎn),而且能保障填料的均勻性[19]。在此基礎(chǔ)上,該團(tuán)隊(duì)又制備了氮摻雜CDs修飾多孔硅膠色譜固定相[88],實(shí)現(xiàn)了羅紅霉素等7種標(biāo)準(zhǔn)樣品抗生素的分離,與商業(yè)柱XBridge HILIC、GlobalsilTMAmino以及Sil-Glc-CDs相比,具有更好的分離性能。該固定相可在9 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)羅紅霉素膠囊中羅紅霉素的有效分離,對(duì)羅紅霉素測(cè)定的理論塔板數(shù)為50 100 N/m。此外,這兩種固定相對(duì)人參皂苷、氨基酸等也具有很好的分離效果。Wu等[89]開發(fā)了一種新型兩親性CDs,與多孔硅膠結(jié)合制備的固定相,同時(shí)具有親水性和疏水性,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的抗生素、核苷以及多環(huán)芳烴等物質(zhì)具有良好的分離效果,該類兩親性CDs修飾硅膠固定相在混合分離模式下具有良好的發(fā)展前景。此外,在色譜固定相中引入CDs能有效改善多孔硅膠固定相的峰拖尾現(xiàn)象,有效提高分離柱效。雖然,CDs是一種優(yōu)異的色譜材料,但基于CDs合成材料直接用于環(huán)境樣品中抗生素分離分析相關(guān)工作的報(bào)道較少[90],發(fā)展尺寸可控、多功能化的CDs對(duì)解決環(huán)境樣品中抗生素的分析檢測(cè)問題具有重要意義。

此外,碳點(diǎn)以及其他碳材料也被用作吸附材料,分離檢測(cè)抗生素。如Yang等[91]首次制備了一種基于零維N、S共摻雜碳點(diǎn)、二維金屬有機(jī)骨架(metal organic frameworks, MOF)以及三維鋯(Zr)-MOF的智能吸附劑UiO-67/NSCN,用于水中TC的檢測(cè),在0.08～20.0 mg/L范圍內(nèi),TC的檢出限為0.063 mg/L,該吸附劑對(duì)TC具有很好的識(shí)別能力。當(dāng)該吸附材料轉(zhuǎn)化為二維納米材料時(shí),對(duì)TC的吸附量可達(dá)到427.35 mg/g;當(dāng)轉(zhuǎn)化為三維材料時(shí),可實(shí)現(xiàn)水中TC的去除,且UiO-67/NSCN已被證明是一種無毒安全、智能化材料,該方法有效改善了碳點(diǎn)的分散性能,使其可作為吸附劑分離抗生素。Peng等[92]利用分子印跡聚合物的高選擇性以及碳納米管的強(qiáng)吸附能力,對(duì)傳統(tǒng)的攪拌萃取進(jìn)行了改造,用于測(cè)定水樣中痕量頭孢克洛和頭孢氨芐,其富集系數(shù)分別為45.5和45.2,檢出限分別為3.5 ng/mL和3.0 ng/mL,磁性碳納米管的加入,使得吸附、洗滌、洗脫這些步驟一步就可以完成。CDs作為一種新型納米材料,雖具有較大的表面積和吸附能力,但目前合成的CDs具有大量的活性基團(tuán)(如-COOH等)以及很強(qiáng)的分散能力[93],這使得CDs作為吸附材料在抗生素樣品前處理中的應(yīng)用受限,因此需要發(fā)展不同類型的CDs以及合成方法來解決這一問題。

此外,CDs良好的生物相容性以及分散性,使得CDs可與抗生素結(jié)合,在色譜儀器檢測(cè)下實(shí)現(xiàn)更低的檢出限。Lahouidak等[94]用水熱蝕刻法制備了CDs,將CDs加入抗生素的水溶液中,采用毛細(xì)管電泳分離,結(jié)合熒光檢測(cè),對(duì)牛奶中的OFL進(jìn)行分析,檢出限和定量限分別為10.7 ng/mL和35.5 ng/mL。此外,上述體系還可用于7種標(biāo)準(zhǔn)氟喹諾酮類抗生素樣品的分析檢測(cè),與HPLC等方法相比,具有成本低、消耗有機(jī)溶劑少等優(yōu)點(diǎn)。采用GQD使毛細(xì)管電泳對(duì)目標(biāo)物的檢出限達(dá)到μg/L級(jí),比固相萃取-毛細(xì)管電泳法測(cè)得的檢出限低40倍[95],且分析速度更快。另外,Taranova等[96]基于不同顏色的水溶性量子點(diǎn)(quantum dots, QDs)的標(biāo)記作用,建立了能夠檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)中抗生素的免疫層析法,即“交通燈”法(見圖4)。該工作對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中OFL、CAP、STR的檢出限分別為0.3、0.12和0.2 ng/mL,比酶聯(lián)免疫法測(cè)得3種抗生素的檢出限低40～300倍[97-99],對(duì)牛奶樣品中OFL進(jìn)行檢測(cè)時(shí),檢測(cè)時(shí)間僅為10 min,是ELISA法的1/18。隨著樣品濃度的升高,相應(yīng)測(cè)試區(qū)的顏色強(qiáng)度降低為零,該方法檢測(cè)范圍寬、重復(fù)性好、靈敏度高,分析物可回收且儀器檢測(cè)的誤差小(不大于8%),具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

圖 4 “交通燈”免疫層析法檢測(cè)抗生素的原理圖[96]Fig. 4 Schematic diagrams of antibiotic detection by traffic light immunochromatography test[96] a. test strip before the assay; b. assay results for the sample containing STR; c. assay results for the sample containing CAP and OFL. 1. test zone for streptomycin (STR); 2. test zone for chloramphenicol (CAP); 3. test zone for ofloxacin (OFL); 4. STR conjugate antibody; 5. CAP conjugate antibody; 6. OFL conjugate antibody; 7. control line.

CDs具有穩(wěn)定的碳核和豐富的表面基團(tuán),可作為分離材料用于色譜分離。利用CDs合成的固定相具有更強(qiáng)的選擇性和識(shí)別性,已引起研究者的關(guān)注。傳統(tǒng)的色譜分析(高效液相色譜法、氣相色譜法等)與之相比,雖具有高靈敏度和準(zhǔn)確性,但存在樣品前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)、消耗有機(jī)溶劑多等問題[100]。CDs與色譜技術(shù)結(jié)合可在一定程度上簡化樣品前處理過程、提高檢測(cè)靈敏度以及節(jié)約成本。但目前基于CDs作為色譜分離材料的機(jī)理還不清楚,有待進(jìn)一步研究[19]。

3 總結(jié)與展望

本文針對(duì)CDs在抗生素檢測(cè)中的應(yīng)用,對(duì)近5年發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了總結(jié)歸納。包括以下幾點(diǎn):(1)重點(diǎn)介紹了CDs在傳感器中的應(yīng)用,CDs獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)等性質(zhì)有效提高了傳感器檢測(cè)靈敏度,使其成為傳感器中最具潛力的替代材料。如今,基于CDs的生物傳感器、光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器被廣泛應(yīng)用于抗生素的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了環(huán)境及食品基質(zhì)中抗生素的有效檢測(cè)。(2)CDs的小尺寸效應(yīng)及兩親特性,使其易與色譜技術(shù)結(jié)合用于抗生素的檢測(cè),但目前相關(guān)研究仍然較少,這可能與抗生素的檢測(cè)基質(zhì)復(fù)雜、可用于抗生素前處理的CDs種類有限,以及CDs作為色譜分離材料的機(jī)理并不完全清楚有關(guān)。(3)目前,基于CDs材料檢測(cè)抗生素的基質(zhì)比較單一,對(duì)湖水、土壤等復(fù)雜環(huán)境樣品中抗生素的分析檢測(cè)還相對(duì)較少,且由于CDs的尺寸、功能在合成過程中易受實(shí)驗(yàn)溫度、時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)人員操作水平的影響,所以對(duì)于一些小尺寸、功能特殊的CDs合成還處在實(shí)驗(yàn)室階段。在未來,發(fā)展新型的CDs制備技術(shù)及材料摻雜技術(shù),合成性能優(yōu)異的CDs,并深入研究基于CDs材料的作用機(jī)理,對(duì)解決環(huán)境樣品中抗生素的分析檢測(cè)難題具有重要意義。