邢德智 （西安市臨潼區(qū)代王初級(jí)中學(xué) 陜西西安 710611）

三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)（three-point test）是基因定位（gene mapping）最常用的方法，主要目的是根據(jù)基因之間的（染色體片段）交換值（cross-over value，交換百分率）確定基因之間的排列次序和相對(duì)距離進(jìn)而繪制連鎖遺傳圖（linkage map）。遺傳圖距（genetic distance）是由交換值確定的，但在三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中通過(guò)表現(xiàn)型（phenotype）數(shù)據(jù)測(cè)算出的直接結(jié)果是重組值（recombinant value，重組百分率）而非交換值；考慮到雙交換和多交換，重組值理論上低于交換值，實(shí)際結(jié)果也往往反映出這樣的關(guān)系；重組值（率）在任何情況下都不能大于0.5（50%）但是在作圖函數(shù)中，與遺傳距離對(duì)應(yīng)的交換值可大于0.5。本文探討兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)和三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中交換值被低估的原因及其對(duì)應(yīng)的校正方法，以及四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中交換值的計(jì)算方法及重組值的校正機(jī)理。

1 確定遺傳圖距時(shí)為什么要對(duì)重組值進(jìn)行校正

1.1 重組值、交換值和遺傳圖距之間的關(guān)系 重組值和交換值的關(guān)系為：在2 個(gè)基因間遺傳圖距較短時(shí)，基因之間幾乎只發(fā)生單交換，重組值接近交換值。遺傳圖距較遠(yuǎn)時(shí)，由于雙交換、多交換發(fā)生機(jī)會(huì)增大，可檢測(cè)出雙交換的三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)或重組值較大的兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中，重組值與交換值差別較大（詳見1.3 和2.2），重組值和交換值的關(guān)系需要通過(guò)雙交換、多交換率或作圖函數(shù)進(jìn)行校正。

根據(jù)定義，交換值與遺傳圖距之間的關(guān)系為：遺傳圖距是用交換值表示2 個(gè)基因之間的相對(duì)距離，以1%交換值去掉% 作為遺傳圖距單位（map unit，mu）；為了紀(jì)念摩爾根（T. H. Morgen），該單位又稱厘摩或分摩爾根（centi-Morgen，cM）。從測(cè)交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算出的是重組值而非交換值，在實(shí)際應(yīng)用中往往需要將單交換重組值通過(guò)雙交換重組值或作圖函數(shù)校正為交換值。

1.2 三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中何時(shí)需1 倍、何時(shí)需2 倍雙交換值校正 果蠅有刺眼（ec）、截翅（ct）和橫脈缺失（cv）。將三雜合雌果蠅（ec ct+/+ +cv）與雄果蠅（ec ct cv/Y）測(cè)交，測(cè)交結(jié)果有8 種表現(xiàn)型，其中：親組合型（ec ct+）為2 125 只、（+ +cv）為2 207只，單交換Ⅰ型（ec+cv）為273 只、（+ct+）為265只，單交換Ⅱ型（ec+ +）為217 只、（+ct cv）為223只，雙交換型（+ + +）為5 只、（ec ct cv）為3 只；根據(jù)8 種 結(jié) 果 及 其 比 例 得 出ec、ct、cv為 連 鎖 基 因而且順序?yàn)閑c-cv-ct，將測(cè)交結(jié)果整理為表1［1］進(jìn)行連鎖遺傳分析。

表1 ec ct+/++cv×ec ct cv/Y測(cè)交結(jié)果［1］

分析表明，單交換Ⅰ重組值10.1%是ec-cv間發(fā)生單交換導(dǎo)致的，雙交換重組值0.15%是ec-cv間和cv-ct間均發(fā)生1 次單交換導(dǎo)致的，但單交換Ⅰ重組值10.1%并未包括0.15%；同樣道理單交換Ⅱ重組值8.3%也未包括0.15%。因此，三點(diǎn)測(cè)交實(shí)驗(yàn)中，在有雙交換重組值時(shí)，如果用實(shí)測(cè)的單交換重組值直接替代相鄰2 個(gè)基因間的交換值，則交換值一定被低估了，圖距隨之縮小了；當(dāng)用2種實(shí)測(cè)的單交換重組值計(jì)算最遠(yuǎn)2 個(gè)基因間的交換值（18.4%）時(shí)，既未包括ec-cv間的0.15%也未包括cv-ct間的0.15%，自然要加上2 倍的雙交換重組值才能接近最遠(yuǎn)2 個(gè)基因間的交換值。所以，用對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)的單交換重組值加1 倍實(shí)測(cè)的雙交換重組值計(jì)算ec-cv間和cv-ct間相鄰基因間的交換值（10.1%+0.15%=10.3%；8.3%+0.15%=8.4%）；用實(shí)測(cè)的單交換Ⅰ、Ⅱ重組值之和加2 倍的實(shí)測(cè)的雙交換重組值計(jì)算ec-ct間最遠(yuǎn)基因間的交換值（10.1%+8.3%+2×0.15%=18.7%）。

這樣才能正確地反映實(shí)際發(fā)生交換的頻率。根據(jù)校正后的交換值繪制染色體圖（chromosome map）（圖1b）。如果不用2 倍雙交換重組值校正2 種實(shí)測(cè)的單交換重組值，基因ec-cv間的圖距是10.3,基因cv-ct間的圖距是8.4 ,則基因ec-ct間的圖距是18.4；不等于基因ec-cv和cv-ct之和18.7（圖1a），所以，計(jì)算最遠(yuǎn)2 個(gè)基因間的交換值時(shí)，需要加上2 倍實(shí)測(cè)雙交換重組值校正，其本質(zhì)是分別校正了2 種實(shí)測(cè)的單交換重組值。

圖1 果蠅基因ec-cv-ct 染色體圖

1.3 為什么要用作圖函數(shù)校正 當(dāng)2 個(gè)連鎖基因之間只發(fā)生單交換，重組值接近交換值，二者相當(dāng)于一次函數(shù)關(guān)系。但當(dāng)發(fā)生“二線雙交換（或二線偶數(shù)次交換）”時(shí)，并不導(dǎo)致標(biāo)記基因重組；發(fā)生“二線三交換（或二線奇數(shù)次交換）”時(shí)，標(biāo)記基因重組的結(jié)果與單交換（一次交換）的結(jié)果完全相同；所以，對(duì)于交換導(dǎo)致重組的結(jié)果而言，偶數(shù)次交換相當(dāng)于0 交換，除1 外的奇數(shù)次交換相當(dāng)于單交換，即2 個(gè)連鎖基因之間偶數(shù)次交換不導(dǎo)致重組只有奇數(shù)次交換才會(huì)導(dǎo)致重組［2］；根據(jù)n個(gè)連鎖基因性母細(xì)胞交換種類計(jì)算式C1n-1種單交換，C2n-1種雙交換，C3n-1種三交換，…，Cn-1n-1種（n-1）交換，當(dāng)n=2 時(shí)交換種類只有C12-1=1種單交換，即2 個(gè)連鎖基因間不論發(fā)生多少次交換，測(cè)算出的只能是1 種“單交換”重組值，而這個(gè)“單交換”重組值完全沒(méi)有反映出發(fā)生的偶數(shù)次交換、未完全反映出發(fā)生的除1 外的奇數(shù)次交換，從而導(dǎo)致這2 種情況下重組值都低于交換值，二者是非一次函數(shù)的特殊函數(shù)關(guān)系,自變量的變化值與函數(shù)的變化值不成正比例。因此，當(dāng)2 個(gè)連鎖基因間的距離較遠(yuǎn)重組值較大時(shí),由于可能發(fā)生雙交換或多交換（奇數(shù)次或偶數(shù)次），以及重組值中不反映（或不完全反映）2 個(gè)連鎖基因之間發(fā)生了雙交換或多交換，所以，重組值往往低于交換值，需要用霍爾丹（Haldane）作圖函數(shù)校正（相關(guān)論述可參考遺傳學(xué)教材[3]）。

正因交換不一定導(dǎo)致重組，或交換與重組不是對(duì)應(yīng)關(guān)系，重組值和交換值在這種情況下確實(shí)是不同的。

2 四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中交換值的計(jì)算方法及重組值的校正機(jī)理

2.1 四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中需要3 種雙交換和1 種三交換重組值校正 假設(shè)“四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”有3 種單交換、3 種雙交換、1 種三交換重組值，4 個(gè)基因在染色體上的順序是a-b-d-e，單交換i、ii、iii 分別是a-b、b-d、d-e間各發(fā)生1 次交換導(dǎo)致的；雙交換和三交換分別是單交換i、ii、iii 的i、ii，ii、iii，i、iii 或i、ii、iii同時(shí)發(fā)生導(dǎo)致的。各種交換的情況見表2 及圖2，用3 段尺寸線表示在a-b、b-d、d-e間分別發(fā)生了1 次交換，染色體圖下面表示染色體上同時(shí)發(fā)生了2 次交換且因交換位置不同而形成不同的雙交換及同時(shí)發(fā)生了3 次交換形成三交換：

圖2 基因a-b-d-e 交換圖

由于四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)的難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)，而三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)已解決了相關(guān)的實(shí)際問(wèn)題，所以四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)的資料較少見；表2 是一個(gè)四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)的結(jié)果，則其交換值計(jì)算方法如下：

表2 四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)結(jié)果分析

1）a-b、b-d、d-e相鄰2 個(gè)基因1 段基因圖距間交換值依次為：

①a-b間交換值=單交換i 重組值+1 倍（雙交換i+雙交換iii+三交換）重組值=9.3%+0.23%+0.53%+0.07%=10.1%。

②b-d間交換值=單交換ii 重組值+1 倍（雙交換i+雙交換ii+三交換）重組值=6.6%+0.23%+0.37%+0.07%=7.3%。

③d-e間交換值=單交換iii 重組值+1 倍（雙交換ii+雙交換iii+三交換）重組值=10.3%+0.37%+0.53%+0.07%=11.2%。

2）a-d、b-e相鄰3 個(gè)基因2 段基因圖距間交換值依次為：

①a-d間交換值=（單交換i+單交換ii）重組值+2 倍雙交換i 重組值+1 倍（雙交換ii+雙交換iii）重組值+2 倍三交換重組值=9.3%+6.6%+2×0.23%+0.37%+0.53%+2×0.07%=17.4%。

②b-e間交換值=（單交換ii+單交換iii）重組值+1 倍 雙 交 換i 重 組 值+2 倍 雙 交 換ii 重 組 值+1 倍雙交換iii 重組值+2 倍三交換重組值=6.6%+10.3%+0.23%+2×0.37%+0.53%+2×0.07%=18.5%。

3）a-e最遠(yuǎn)間4 個(gè)基因3 段基因圖距交換值a-e間交換值=1 倍（單交換i+單交換ii+單交換iii）重組值+2 倍(雙交換i+雙交換ii+雙交換iii)重組值+3 倍三交換重組值=9.3%+6.6%+10.3%+2×（0.23%+0.37%+0.53%）+3×0.07%=28.7%。

最遠(yuǎn)2 個(gè)基因之間的交換值28.7%與由a-b、b-d、d-e間交換值之和（10.1%+7.3%+11.2%）相吻合。反映出最遠(yuǎn)2 個(gè)基因之間的交換值=校正后所有連續(xù)相鄰2 個(gè)基因間的交換值之和；即：最遠(yuǎn)2 個(gè)基因之間的遺傳圖距=所有連續(xù)相鄰2 個(gè)基因間的遺傳圖距之和。

四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中交換值計(jì)算方法揭示出相鄰2 個(gè)基因間、最遠(yuǎn)2 個(gè)基因間和任意2 個(gè)基因間的交換值計(jì)算規(guī)律是：

1）相鄰2 個(gè)基因間的交換值=某1 種（對(duì)應(yīng)的）單交換重組值+1 倍某2 種（相關(guān)）雙交換重組值之和+1 倍三交換重組值；不論是幾交換重組值，其對(duì)應(yīng)的交換最多與相鄰2 個(gè)基因間相關(guān)1次，計(jì)算時(shí)都用1 倍值。這間接說(shuō)明兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)檢測(cè)不出2 個(gè)基因間發(fā)生了雙交換和多交換，因此需要作圖函數(shù)校正。

2）任意2 個(gè)基因間的交換值=相關(guān)的單交換重組值之和+相關(guān)雙交換所涉及的交換次數(shù)×相關(guān)雙交換的重組值+三交換所涉及的交換次數(shù)×三交換重組值；例如，b-e間的交換值=（單交換ii+單交換iii）的重組值+（1×雙交換i 的重組值+2×雙交換ii 的重組值+1×雙交換iii 的重組值)+2×三交換的重組值，即6.6%+10.3%+0.23%+2×0.37%+0.53%+2×0.07%。此算式中交換值的計(jì)算規(guī)律更清楚地揭示出校正值“倍數(shù)”的本質(zhì)是形成該重組配子時(shí)在所計(jì)算的2 個(gè)基因間的相關(guān)交換所涉及的交換次數(shù)。

3）表2 中每個(gè)區(qū)間的交換值等于該區(qū)間涉及的所有重組值之和；其中單交換重組值只用1 倍值，雙交換和三交換重組值可能要用幾倍值，用幾倍值取決于它們?cè)谶@個(gè)區(qū)間所涉及的交換次數(shù)（“√”的個(gè)數(shù)，無(wú)“√”空白處個(gè)數(shù)為0）。

“四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”中交換值的計(jì)算為什么能揭示出用幾倍值校正的道理？“三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”中只有相鄰2個(gè)基因1 段基因圖距、相鄰3 個(gè)基因2 段基因圖距2 種交換值的計(jì)算，并且校正值只涉及1 種雙交換值，因此根本無(wú)法說(shuō)清楚“倍數(shù)”的本質(zhì)。林毅在論述四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)方法時(shí)，未說(shuō)明四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中為什么產(chǎn)生3 種單交換、3 種雙交換、1 種三交換，自然無(wú)法厘清單交換與雙交換及三交換的關(guān)系；在計(jì)算交換值時(shí)只涉及4 個(gè)連鎖基因中相鄰2 個(gè)基因之間交換值的計(jì)算，同樣無(wú)法說(shuō)清楚“倍數(shù)”的本質(zhì)。

本“四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”交換結(jié)果除了涉及7 種交換重組值外，還涉及相鄰2 個(gè)基因1 段基因圖距、相鄰3 個(gè)基因2 段基因圖距和最遠(yuǎn)4 個(gè)基因3 段基因圖距3 種情況的交換值計(jì)算，它們都包括在“任意2個(gè)基因間交換值的計(jì)算”里。這個(gè)算式具有普遍意義并且校正時(shí)涉及多種雙交換和三交換；而且用雙交換值校正時(shí)情況較為復(fù)雜——例如，某種雙交換與2 個(gè)基因間無(wú)關(guān)或相關(guān)1 次，最多相關(guān)2次，校正時(shí)對(duì)應(yīng)的“倍數(shù)”分別為0、1、2。這樣就可清楚地揭示校正值“倍數(shù)”的本質(zhì)。

綜上所述,多點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中任意2 個(gè)基因間的交換值主要由相關(guān)的單交換重組值決定，但要估算出較準(zhǔn)確的基因間交換頻率，還需要用雙交換、多交換重組值校正。用幾倍重組值校正取決于它們?cè)谶@2 個(gè)基因之間所涉及的交換次數(shù)。四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中不論是雙交換重組值還是多交換重組值在相鄰2 個(gè)基因間最多測(cè)出1 次交換所得的重組值，所以都是用1 倍值校正（a-b、b-d、d-e間交換值）；雙交換、多交換重組值是在2 段或3 段基因圖距上發(fā)生2 次單交換及多次單交換導(dǎo)致的，所以通常用2 倍值、多倍值校正?？傊噜? 個(gè)基因之間不論是幾交換重組值，都是用1 倍值校正；最遠(yuǎn)2 個(gè)基因之間是幾交換重組值，就用幾倍值校正；任意2 個(gè)基因之間用幾個(gè)雙交換、多交換重組值校正取決于這2 個(gè)基因之間相關(guān)雙交換、多交換的種類及種類個(gè)數(shù)，用幾倍值校正取決于該交換在這2 個(gè)基因之間所涉及的交換次數(shù)?！八狞c(diǎn)測(cè)驗(yàn)”中任意2 個(gè)基因間雙交換、三交換重組值校正時(shí)的“倍數(shù)”分別為0、1、2 和1、2、3，即雙交換重組值最大用2 倍值進(jìn)行校正，也可能用1 倍值或0 倍值去校正、三交換重組值最大用3 倍值校正，也可能用2 倍值或1 倍值進(jìn)行校正。用0 倍值去校正指這2 個(gè)基因間的交換值與該種雙交換重組值無(wú)關(guān)。

“三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”通常有2 種單交換，最多有1 種雙交換，情況比“四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”簡(jiǎn)單。“三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”中因?yàn)樾纬呻p交換重組配子時(shí)，是中間基因與兩側(cè)相鄰的2 個(gè)基因間分別交換1 次，即同時(shí)發(fā)生的2次交換也就是雙交換，其重組的結(jié)果統(tǒng)計(jì)到實(shí)測(cè)雙交換值里了，而相鄰的2 個(gè)基因間的單交換重組值并未包括這部分雙交換值，所以，估算相鄰2個(gè)基因間的交換值，要用實(shí)測(cè)的單交換重組值加上1 倍雙交換重組值校正；而形成雙交換重組配子時(shí)在最遠(yuǎn)的2 個(gè)基因間（實(shí)際上為3 個(gè)基因2 段基因圖距間）交換了2 次也未包括這部分雙交換值，因此，估算最遠(yuǎn)2 個(gè)基因間的交換值，要用實(shí)測(cè)的2 種單交換重組值之和加上2 倍雙交換重組值校正。有雙交換重組值時(shí)，相鄰2 個(gè)基因或最遠(yuǎn)2 個(gè)基因間的單交換重組值一定低于對(duì)應(yīng)節(jié)段上基因間的交換值，只有通過(guò)1 倍或2 倍雙交換重組值校正，才能正確地反映基因間實(shí)際發(fā)生交換的頻率進(jìn)而得到較為準(zhǔn)確的遺傳圖距。例如，前述“果蠅有刺眼（ec）、截翅（ct）和橫脈缺失（cv）”基因間交換值的計(jì)算。

這就是“三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”中交換值低估的原因，以及三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)和四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中重組值校正的方法。

2.2 四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)與Haldane 作圖函數(shù) 兩點(diǎn)測(cè)驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)出2 個(gè)基因間發(fā)生了雙交換和多交換。如果四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)中不考慮居間基因b和d，則無(wú)法反映出a-e間發(fā)生的3 種雙交換和1 種三交換、只能檢測(cè)出1 種單交換，其數(shù)值就是3 種單交換重組值之和（2 個(gè)標(biāo)記基因間不論何處發(fā)生了1 次交換，結(jié)果形成同一類型的重組型配子）；不校正之前交換值肯定被低估了。當(dāng)考慮居間基因b和d，相當(dāng)于在a-e間增添了2 個(gè)標(biāo)記基因，就可檢測(cè)出a-e間發(fā)生的雙交換和多交換。

a-b、a-d和a-e間遺傳圖距依次增大，每一個(gè)區(qū)間涉及的交換總次數(shù)也相應(yīng)增多（表2 中對(duì)應(yīng)區(qū)間的對(duì)號(hào)總數(shù)，即4、8、12）,這與Haldane 作圖函數(shù)中，交換平均數(shù)越大，遺傳圖距也越大規(guī)律相吻合；或者說(shuō)四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)分析反映的規(guī)律，比三點(diǎn)測(cè)驗(yàn)更清楚地解釋了Haldane 作圖函數(shù)中，遺傳圖距隨著交換平均數(shù)變化的道理。

3 小結(jié)

遺傳圖距是按交換值確定的，根據(jù)三點(diǎn)測(cè)交實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)直接計(jì)算出的是重組值而非交換值，通過(guò)實(shí)測(cè)雙交換重組值或作圖函數(shù)校正間接計(jì)算出數(shù)值才是交換值。當(dāng)有雙交換重組值時(shí)，重組值一定小于交換值，一定要用雙交換重組值校正，用幾倍值校正取決于形成該種重組型配子時(shí)這2 個(gè)基因之間交換的次數(shù)；相鄰2 個(gè)基因之間用1 倍值校正，最遠(yuǎn)2 個(gè)基因之間用2 倍值校正。“四點(diǎn)測(cè)驗(yàn)”中任意2 個(gè)基因間交換值計(jì)算式具有普遍意義，用重組值校正時(shí)涉及多種雙交換和三交換，從而清楚地揭示出重組值校正值“倍數(shù)”的本質(zhì)是相關(guān)交換在這2 個(gè)基因間所涉及的交換次數(shù)。當(dāng)沒(méi)有雙交換重組值而且2 個(gè)連鎖基因相距的遺傳圖距較遠(yuǎn)、重組值較大時(shí)，由于可能發(fā)生雙交換或多交換，重組值也往往小于交換值，需要用Haldane 作圖函數(shù)校正。

交換值確定遺傳圖距，它是個(gè)固定值。當(dāng)2個(gè)基因的遺傳圖距較近只發(fā)生單交換時(shí)，交換值直接用單重組值替代；遺傳圖距較遠(yuǎn)發(fā)生雙交換和多交換時(shí)，重組值要校正為交換值。所以，確定遺傳圖距時(shí)往往要對(duì)單交換重組值進(jìn)行校正。本研究主要幫助學(xué)習(xí)者理解重組值的校正機(jī)理，減少交換值計(jì)算上的錯(cuò)誤，加深對(duì)重組值、交換值概念及二者關(guān)系本質(zhì)的理解，特別是對(duì)重組值校正“倍數(shù)”本質(zhì)及Haldane 作圖函數(shù)校正機(jī)理的理解。