梁家宏，許僑東，嚴 江

(汕頭大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普外科，廣東 汕頭 515041)

肝細胞癌是最常見的致死性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，肝細胞癌在所有的癌癥相關(guān)死亡中排第2位，在最常見的腫瘤類型中排第6位[1]。我國肝癌的發(fā)病率和病死率均居第2位[2]。目前，手術(shù)切除仍然是治療肝癌的主要措施，但是約60%的患者在行根治性肝切除術(shù)后5年內(nèi)仍會經(jīng)歷腫瘤的復發(fā)或者轉(zhuǎn)移，肝癌患者的遠期預后仍不理想[3]。因此，對肝細胞癌的發(fā)病機制進行深入研究，從而為臨床治療提供理論依據(jù)，對于改善我國肝癌現(xiàn)狀具有重要意義。

熱休克蛋白90ABl(heat shock protein 90 kDa alpha，class B member 1，Hsp90AB1)是熱休克蛋白90的4種亞型之一。熱休克蛋白是ATP依賴的高度保守的分子伴侶，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量參與蛋白質(zhì)的正確折疊，從而在細胞周期的運行，細胞的增殖、遷移、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[4-6]。目前的研究表明Hsp90AB1在多種腫瘤組織中過表達，并且在胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中具有促癌作用[7-9]。在肝細胞癌中，新近的研究發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1具有促進血管生成的作用[10]。然而對于Hsp90AB1在肝細胞癌中的作用與機制仍有待進一步深入研究。本研究對Hsp90AB1在肝細胞癌中的生物學功能及作用機制進行探究，為肝細胞癌臨床治療發(fā)現(xiàn)新的靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

人正常肝細胞系L02及肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1均購自中國科學院上海細胞庫，肝細胞癌組織芯片DLV013購自西安泰博斯生物科技有限公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自大連寶生物工程有限公司，Bradford蛋白定量試劑盒購自美國Amresco公司，ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司，SP法免疫組織化學檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Hsp90AB1抗體購自蘇州百遠生物科技有限公司。NanoDrop 2000超微量紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，LightCycler 480熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化 將肝細胞組織芯片按照說明書進行Hsp90AB1蛋白的免疫組化染色。以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，根據(jù)著色細胞占視野細胞總數(shù)的百分比及著色細胞染色的強弱作為免疫組化評分標準。著色細胞百分比：＞75%為4分，51%～75%為3分，26%～50%為2分，6%～25%為1分，≤5%為0分。染色強弱：強(+++)3分，中(++)2分，弱(+)1分，陰性0分。兩者的乘積作為免疫組化的評分。

1.2.2 qRT-PCR實驗 按照TRIzol說明書對正常肝細胞系L02及肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1進行RNA提取。使用NanoDrop 2000分光光度計測量RNA濃度，通過A260/A280比值或者甲醛變性膠電泳實驗檢測RNA質(zhì)量。質(zhì)量合格的RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，依次加入RNA、 5 × PrimeScript buffer、 PrimeScript RT Enzyme Mix、RT Primer Mix、ddH2O，充分混勻，37℃15 min，85℃5 s。qRT-PCR的總反應體系為 10 μL，SYBR Green mix 5 μL，正反向引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA 1 μL。PCR反應條件為：95℃預熱5 min，95℃變性10 s，60℃退火、延伸30 s，總共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt方法計算相對表達量。

1.2.3 生物信息學分析方法 肝細胞癌相關(guān)基因芯片GSE54238的基因數(shù)據(jù)在GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載獲得。使用在線軟件Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)分析正常肝組織和肝癌組織之間的差異表達基因。使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancerpku.cn/)分析Hsp90AB1在肝細胞癌和正常肝組織中的表達情況。使用GEPIA數(shù)據(jù)庫對肝細胞癌患者根據(jù)Hsp90AB1的表達水平差異進行生存分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2組間比較用采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。生存分析使用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學檢測Hsp90AB1在肝細胞癌組織芯片中的表達

肝細胞癌組織芯片包含40例正常肝組織和40例肝細胞癌組織。免疫組織化學檢測結(jié)果顯示：與正常肝組織相比，Hsp90AB1在肝細胞癌組織中表達上調(diào)(圖1和圖2)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 Hsp90AB1在肝細胞癌組織芯片中的表達 (免疫組織化學染色，上圖×20，下圖×40)

圖2 Hsp90AB1在肝細胞癌組織中表達的免疫組化評分

2.2 生物信息學分析肝細胞癌相關(guān)基因芯片GSE54238差異表達基因

通過生物信息學方法對包括10例正常肝組織標本及13例晚期肝癌組織標本的基因芯片GSE54238進行分析，獲得了50個在正常肝組織和肝細胞癌組織中差異表達的基因(差異倍數(shù)≥2，P＜0.05)，其中包含Hsp90AB1基因(NM_007355)。相比于正常肝組織，Hsp90AB1基因在肝細胞癌組織中表達上調(diào)(圖3)。提示Hsp90AB1基因可能為肝細胞癌中潛在的關(guān)鍵基因。

圖3 Hsp90AB1基因在肝細胞癌基因芯片中高表達

2.3 生物信息學分析Hsp90AB1基因在肝細胞癌組織樣本中的表達

通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，Hsp90AB1基因在肝癌組織中過表達(P＜0.05)，圖4。

圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示Hsp90AB1基因在肝細胞癌組織中高表達

2.4 生物信息學分析Hsp90AB1與肝細胞癌患者預后的相關(guān)性

通過在線數(shù)據(jù)庫GEPIA分析發(fā)現(xiàn)，Hsp90AB1高表達的肝癌患者預后較差(P＜0.01)，圖5。

圖5 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示Hsp90AB1高表達的肝癌患者預后較差

2.5 Hsp90AB1基因在肝癌細胞系中的表達

通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，相比于正常肝細胞系L02，Hsp90AB1基因在肝癌細胞系SMMC-7721、HepG2、SK-Hep1中的表達均上調(diào)(P＜0.05)，圖6。

圖6 Hsp90AB1基因在肝癌細胞系中表達上調(diào)

3 討論

目前由于缺乏有效的預后預測生物標志物及分子靶向機制研究進展緩慢，肝癌患者的預后仍較差。迫切需要尋找有效的分子標志物來改善肝癌患者的預后。Hsp90AB1屬于Hsp90家族的一員。Hsp90是一種分子量大小為90 kDa的熱休克蛋白，它能夠維持主要細胞蛋白的功能，包括激素受體、蛋白激酶以及控制細胞周期和細胞凋亡的蛋白。它能夠保護新翻譯蛋白的正確折疊，也能促進未折疊蛋白的降解[11]。目前研究表明Hsp90AB1在多種實體腫瘤中表達異常并且與患者較差的預后相關(guān)。

有關(guān)Hsp90AB1在肝細胞癌中的研究不多。Meng等[10]研究發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1能促進內(nèi)皮細胞介導的肝癌細胞的血管形成。Xiao等[12]通過免疫相關(guān)基因芯片分析顯示，Hsp90AB1可能為肝細胞癌中潛在的預后預測因子。Meng等[13]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1與肝癌組織中的血管生成擬態(tài)形成相關(guān)，并且能夠促進微管形成，細胞遷移和侵襲。此外，Wang等[14]利用生物信息學對肝細胞相關(guān)基因芯片和臨床數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1可能與自噬相關(guān)并且Hsp90AB1高表達患者的預后相對較差。本研究利用肝細胞癌組織芯片進行免疫組化實驗，發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，Hsp90AB1在肝細胞癌組織中表達上調(diào)。進一步對肝細胞癌相關(guān)基因芯片GSE54238進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1基因在正常肝組織和肝癌組織中存在表達差異，提示Hsp90AB1基因可能為肝癌中潛在的關(guān)鍵基因。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，Hsp90AB1基因在肝細胞癌組織中顯著過表達。生存分析顯示，Hsp90AB1高表達的肝癌患者預后相對較差。并且，相對于正常肝細胞系，Hsp90AB1基因在肝癌細胞系中高表達。

然而，本研究存在一定的缺陷。本研究僅從肝細胞癌組織樣本、肝癌芯片及數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)Hsp90AB1在肝細胞癌中表達上調(diào)，并且表達高低與肝癌患者預后具有相關(guān)性。未進行Hsp90AB1表達與肝癌患者的臨床病理學資料相關(guān)性的分析。未在體內(nèi)及體外實驗中探究Hsp90AB1對肝癌細胞生物學功能的影響。Hsp90AB1在肝細胞癌中的作用機制也有待進一步研究。

綜上所述，通過對肝細胞癌組織樣本研究及肝癌相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學分析驗證，結(jié)果表明Hsp90AB1基因可能為肝細胞癌中潛在的促癌基因。進一步研究Hsp90AB1在肝細胞癌中的生物學功能及作用機制，有可能為探索肝癌臨床診療的新靶點提供理論依據(jù)。