黃漫枝，蔡文鋒，石剛剛

（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041）

缺血性心肌病是危害我國(guó)國(guó)民健康的重大疾病之一，及時(shí)溶栓或經(jīng)皮冠脈介入術(shù)等方法進(jìn)行再灌注是挽救缺血心臟的必需步驟，但該過程常伴隨著嚴(yán)重的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，至今仍缺乏有效的干預(yù)手段。MIRI是一個(gè)復(fù)雜、多因子參與的病理過程，其病理機(jī)制目前尚不明確，可能與鈣超載、氧化應(yīng)激、能量代謝以及炎癥反應(yīng)等有關(guān)。

磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是具有甘油磷脂水解活性的一大類家族酶，其可在甘油磷脂的sn-2位置水解?；I，產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂[1]。PLA2大致可分為：分泌型PLA2、胞質(zhì)型PLA2、不依賴 Ca2+的 PLA2(Ca2+-independent PLA2，iPLA2)和血小板活化因子乙酰水解酶四大類。iPLA2可水解膜磷脂生成花生四烯酸和溶血磷脂酰膽堿[2-3]?；ㄉ南┧峥梢栽谠俟嘧㈦A段促進(jìn)炎癥反應(yīng)[4]，而溶血磷脂酰膽堿被認(rèn)為有致心律失常的作用[5]，造成心肌細(xì)胞鈣離子超載，影響心臟的機(jī)械與代謝活動(dòng)。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，在缺血心肌中iPLA2對(duì)縮醛磷脂的活性增加了10倍，缺血5 min后iPLA2活性達(dá)到最高并持續(xù)了1 h。我們前期在離體實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧過程中，心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染iPLA2質(zhì)粒使iPLA2高表達(dá)后的缺氧再?gòu)?fù)氧損傷加重；轉(zhuǎn)染iPLA2-siRNA沉默iPLA2基因，缺氧再?gòu)?fù)氧損傷減輕，表明iPLA2參與心肌細(xì)胞的缺氧再?gòu)?fù)氧損傷[7]。本研究擬在整體心肌缺血再灌注模型上探討iPLA2表達(dá)的時(shí)效性，并借助于iPLA2基因敲除方法，確證iPLA2與MIRI的因果關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6JNifdc小鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，iPLA2-/-的C57BL/6JNifdc小鼠由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司構(gòu)建，飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由本課題組成員飼養(yǎng)繁殖并鑒定基因型。本研究經(jīng)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉購(gòu)自德國(guó)Merck公司；iPLA2兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cayman公司；Tubulin鼠多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；CD68小鼠多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG、Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)購(gòu)自上海碧云天公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司)；Vevo LAZR小動(dòng)物多模成像系統(tǒng)(加拿大Fujifilm VisualSonics公司)；CM1850冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀(日本Toshiba公司)；Olympus BX53正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因型鑒定 將小鼠作好標(biāo)記后采集小鼠鼠尾，保存于EP管中，按DNA提取試劑盒提取總DNA，PCR反應(yīng)體系如下：94℃3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。取10 μL上樣，用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，40 min后觀察DNA條帶。

1.2.2 小鼠心肌缺血再灌注模型的建立 8～10周齡的小鼠禁食12 h后稱重，腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進(jìn)行麻醉。將小鼠通過氣管插管連接呼吸機(jī)，呼吸頻率115，呼吸比1.3∶1，潮氣量2.0。在小鼠第3和第4肋骨間開胸暴露心臟，撕開心包膜后明顯觀察到左心耳位置。使用8-0的帶針縫線結(jié)扎左前降支，造成心肌缺血。缺血結(jié)束后松開結(jié)扎線，進(jìn)行相應(yīng)時(shí)間的再灌注，建立心肌缺血再灌注模型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組。(1)C57BL/6JNifdc小鼠隨機(jī)分成5組：假手術(shù)組(sham組)、不同時(shí)間缺血組(15、30、45、60 min)，每組各6只。(2)C57BL/6JNifdc小鼠隨機(jī)分成8組：sham組、缺血45 min后不同時(shí)間再灌注組(0.5、1、2、3、4、5、6 h)，每組各6只。(3)野生型C57BL/6JNifdc小鼠和iPLA2-/-C57BL/6JNifdc小鼠隨機(jī)各分為2組：sham組和缺血45 min再灌注3 h組，每組各6只。

1.2.4 免疫熒光法觀察CD68的表達(dá) 將小鼠心臟置于冰上，制作厚度8 μm冰凍切片，于冰上用4%多聚甲醛中固定15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，用免疫熒光封閉液室溫封閉1 h。滴加50 μL 稀釋后的CD68抗體(V抗體∶V封閉液=1∶50)，于4℃孵育過夜。第2天常溫下復(fù)溫30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min。以下步驟都需避光。滴加50 μL稀釋后的Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG熒光二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次5 min，DAPI染核5 min，磷酸鹽緩沖液沖洗5 min，滴加抗熒光猝滅封片液，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。通過計(jì)算每組中CD68陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)所占的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)iPLA2蛋白的表達(dá)水平 提取小鼠心肌組織蛋白：按100 mg心肌組織加1 mL蛋白裂解液的比例加入預(yù)冷的蛋白裂解液，用乳化分散儀進(jìn)行組織勻漿，冰上靜置30 min，4℃12 000 r/min離心15 min后收集上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量后按4∶1的比例加入5倍上樣緩沖液，煮沸5 min變性；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(50 V)至分離膠后，更換100 V電壓繼續(xù)電泳1 h；電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光后曝光；Gel-Pro圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.2.6 全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)小鼠血清乳酸脫氫酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶的活性 將小鼠血清用生理鹽水分別稀釋64倍、16倍、16倍，每個(gè)稀釋后的樣本吸取100 μL于檢測(cè)管，用TBA-40FR全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase， LDH)、 肌 酸 激 酶 (creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠心肌缺血再灌注時(shí)iPLA2蛋白表達(dá)的時(shí)效變化

與sham組相比，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，iPLA2的表達(dá)逐漸升高，且在缺血45 min時(shí)達(dá)到峰值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，缺血60 min時(shí)iPLA2的表達(dá)較45 min略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，如圖1A所示。與sham組相比，當(dāng)缺血時(shí)間固定為45 min時(shí)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，iPLA2蛋白的表達(dá)逐漸升高，再灌注3 h時(shí)達(dá)到峰值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，再灌注4、5、6 h時(shí)iPLA2的表達(dá)較再灌注3 h略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，如圖1B所示。因此，選擇缺血45 min再灌注3 h作為后續(xù)研究模型制作的時(shí)間點(diǎn)。

圖1 小鼠心肌缺血再灌注時(shí)iPLA2蛋白表達(dá)的時(shí)效變化

2.2 iPLA2在小鼠MIRI中的作用

2.2.1 iPLA2基因敲除小鼠的鑒定 iPLA2基因敲除小鼠的構(gòu)建方法是敲除iPLA2所在PLA2G6基因的2 817 bp。如圖2所示，雜合子小鼠顯示出526 bp和573 bp兩個(gè)條帶，純合子小鼠即iPLA2基因敲除鼠僅有526 bp條帶，而野生型小鼠僅有573 bp條帶。純合子小鼠和野生型小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，雜合子小鼠予以剔除，不用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 iPLA2基因敲除小鼠的基因型鑒定

2.2.2 iPLA2基因敲除能改善心肌缺血再灌注后血清酶的漏出 野生型小鼠sham組與iPLA2-/-小鼠sham組相比血清酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與野生型小鼠sham組相比，野生型小鼠在缺血再灌注后，CK、CK-MB和LDH的漏出增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與野生型小鼠缺血再灌注組相比，iPLA2-/-小鼠缺血再灌注后CK、CK-MB和LDH的漏出減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，如圖3。

圖3 iPLA2基因敲除改善心肌缺血再灌注后血清酶的漏出

2.2.3 iPLA2基因敲除能改善MIRI中的炎癥反應(yīng) 如圖4所示，圖中的藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核，紅色熒光代表CD68陽性細(xì)胞，通過計(jì)算CD68陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)所占的比例來評(píng)價(jià)組織中巨噬細(xì)胞的多少。野生型小鼠sham組與iPLA2-/-小鼠sham組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與野生型小鼠sham組相比，野生型小鼠心肌缺血再灌注后，心肌組織中CD68標(biāo)記的炎癥細(xì)胞增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與野生型小鼠心肌缺血再灌注組相比，iPLA2-/-小鼠心肌缺血再灌注后心肌組織中CD68標(biāo)記的炎癥細(xì)胞表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 iPLA2基因敲除對(duì)心肌缺血再灌注后CD68表達(dá)的影響

3 討論

本研究顯示在小鼠MIRI中，iPLA2的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)的峰度與缺血或再灌注時(shí)間密切相關(guān)。這與本課題組前期對(duì)于細(xì)胞水平的研究結(jié)果是一致的[8]?；罨膇PLA2可以水解肌膜磷脂造成脂肪酸在細(xì)胞膜上的積累和溶血磷脂酰膽堿的釋放增加。這兩種產(chǎn)物具有多種效應(yīng)，介導(dǎo)不同信號(hào)通路而產(chǎn)生不利于損傷恢復(fù)的反應(yīng)，通過參與離子通道的調(diào)節(jié)對(duì)一系列炎癥、凋亡等反應(yīng)產(chǎn)生作用，尤其在MIRI中發(fā)揮重要作用。Mancuso等[9]采用Langendorff方法制作缺血模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)iPLA2小鼠在缺血幾分鐘內(nèi)即可發(fā)生惡性室性快速心律失常，給予iPLA2抑制劑后的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生惡性室性快速心律失常的概率降低。Moon等[10]的研究表明，與野生型小鼠比較，iPLA2γ敲除小鼠在心肌缺血再灌注模型中，其梗死面積明顯減少。由此我們合理地推測(cè)iPLA2不但是心肌缺血還是再灌注損傷中的重要因子。本研究借助于iPLA2基因敲除小鼠，以心肌損傷的幾個(gè)標(biāo)志性血清酶為參數(shù)，證明了iPLA2蛋白的高表達(dá)是MIRI的重要原因。

CD68所標(biāo)記的炎癥細(xì)胞代表組織中的巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中扮演了很重要的角色，其對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞，參與到免疫反應(yīng)中。本研究中iPLA2-/-小鼠MIRI中的炎癥反應(yīng)與野生型小鼠比較得到明顯改善，表現(xiàn)為CD68標(biāo)記的炎癥細(xì)胞表達(dá)減少。這可能與iPLA2的產(chǎn)物花生四烯酸可以在再灌注階段促進(jìn)炎癥反應(yīng)有關(guān)。炎癥反應(yīng)是MIRI中主要病理現(xiàn)象之一，Nelson等[11]的研究用脂多糖刺激從野生型小鼠和iPLA2-/-小鼠分離的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)前列腺素E2在iPLA2-/-小鼠分離的巨噬細(xì)胞中表達(dá)減少，表明iPLA2影響了巨噬細(xì)胞的功能。而本研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，iPLA2還可以增加缺血區(qū)巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量而加重炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究從整體水平上說明了敲除iPLA2基因后對(duì)小鼠MIRI具有保護(hù)作用，因此在MIRI中，具有選擇性和生物可利用性的iPLA2抑制劑可作為一種潛在的治療工具。