蔡一鳴，劉玉珊，王志龍，李春筱，劉 麗

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

噬藻體(Cyanophage)是一種能夠特異性感染藍(lán)藻的雙鏈DNA病毒，在淡水及海洋環(huán)境中廣泛存在，是水生微生物群落的重要組成部分，能在不同時(shí)間和空間范圍內(nèi)感染藍(lán)藻，具有豐富的遺傳多樣性[1]。噬藻體通過侵染宿主藍(lán)藻改變宿主的種群結(jié)構(gòu)，調(diào)控藍(lán)藻豐度、多樣性及群落結(jié)構(gòu)演替，在控制藍(lán)藻引起的水華方面具有巨大的開發(fā)潛力。

對(duì)于噬藻體的研究始于20世紀(jì)60年代, 自1963年SAFFERMAN等[2]成功分離出第1株噬藻體LPP后，研究者們采用傳統(tǒng)的分離純化方法已獲得一系列侵染不同藍(lán)藻的噬藻體，并對(duì)其生物學(xué)特性等進(jìn)行相關(guān)研究[3-5]。根據(jù)噬藻體形態(tài)的不同，可將其分為肌尾噬藻體科(Myoviridae)、短尾噬藻體科(Podoviridae)和長(zhǎng)尾噬藻體科(Siphoviridae)[6]。噬藻體基因具有高度差異性，且缺乏廣泛通用的分子標(biāo)記，導(dǎo)致噬藻體的遺傳多樣性研究較為困難，選擇適合的靶基因成為噬藻體分子生態(tài)學(xué)研究的關(guān)鍵[7]。g20基因能夠編碼大腸桿菌T4型噬菌體衣殼組裝蛋白，具有高度的保守性，目前被廣泛用于肌尾科噬藻體的多樣性研究。ZHONG等[8]根據(jù)g20基因設(shè)計(jì)引物CPS1 /CPS8，成功地從噬藻體分離株和環(huán)境病毒濃縮物樣品中擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為592 bp的g20基因片段，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化地位分析。MARSTON等[9]比較了g20基因3 對(duì)引物發(fā)現(xiàn)，CPS1/CPS2 引物擴(kuò)增范圍較CPS1/CPS4 和CPS1/CPS8 更加廣泛。SULLIVAN等[10]重新設(shè)計(jì)了g20引物CPS1.1 /CPS8.1，對(duì)分離篩選到的所有肌尾科噬藻體都成功擴(kuò)增得到g20基因。g20基因作為噬藻體的一種靶標(biāo)基因，不僅可以用于研究噬藻體的遺傳多樣性，還可以探究噬藻體與其宿主及浮游病毒之間的基因多樣性關(guān)系。

近年來，湖泊富營(yíng)養(yǎng)化已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問題。云南是一個(gè)淡水資源極為豐富的省份，湖泊眾多且類型多樣，但人為活動(dòng)和自然環(huán)境原因引起的水體富營(yíng)養(yǎng)化問題也越來越突出[11]。貧營(yíng)養(yǎng)化撫仙湖和富營(yíng)養(yǎng)化湖泊滇池、星云湖之間環(huán)境因子差異明顯，滇池、星云湖水體的化學(xué)需氧量和溶解氧，葉綠素a，氮、磷濃度均高于撫仙湖，因此富營(yíng)養(yǎng)化程度也遠(yuǎn)高于撫仙湖。有關(guān)噬藻體多樣性及其生態(tài)作用的研究一直倍受關(guān)注，研究噬藻體多樣性有助于了解噬藻體及其與宿主藍(lán)藻的關(guān)系，從而促進(jìn)其對(duì)藍(lán)藻水華的治理。研究選取云南高原湖泊中3個(gè)富營(yíng)養(yǎng)化程度不同的淡水湖泊滇池、星云湖和撫仙湖，采用PCR-克隆技術(shù)對(duì)噬藻體g20基因多樣性進(jìn)行分析，研究不同湖泊噬藻體g20基因多樣性，以期更深入了解噬藻體遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)噬藻體新的基因型。

1 材料與方法

1.1 水樣采集與處理

于2018年秋(10月)、2019年冬季(1月)，在云南滇池、星云湖和撫仙湖使用專用的水樣采集器，分別于表層(距水體表面約 0.5 m 處)和底層(距水體表面約 2 m處)采集水樣，每個(gè)采樣點(diǎn)多點(diǎn)采集水樣后置于滅菌聚乙烯瓶或玻璃瓶中，并迅速運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，將采集的水樣混合后依次通過0.45、0.22 μm 微孔濾膜處理，使用中空纖維膜組件進(jìn)行濃縮，濃縮比例為300∶1，將濃縮水樣置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 噬藻體DNA的提取及PCR擴(kuò)增

使用病毒基因組提取試劑盒〔E.Z.N.A.TMViral DNA Kit(OMEGA)〕提取濃縮水樣噬藻體DNA，將提取好的DNA保存于-20 ℃ 冰箱中。選擇噬藻體g20基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為CPS1.1/CPS8.1[10]：g20-F(5′- GTAGWATWTTYTAYATTGAYGTWGG-3′)和g20-R(5′-ARTAYTTDCCDAYRWAWGGWTC-3′)。PCR擴(kuò)增體系為：2×Premix Taq (TaKaRa)10 μL，Primer-F Primer(10 μmol·L-1)1 μL，Primer-R Primer (10 μmol·L-1) 1 μL，Template(sample) 2 μL，Rnase Freed H2O 6 μL，總體積為20 μL。以陰性對(duì)照無菌 ddH2O為模板。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s；退火30 s(45 ℃)；72 ℃延伸60 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

1.3 回收TA克隆及測(cè)序

使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，使用pEASY ?-T1 Cloning Kit(TransGen Biotech)對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化，通過菌落PCR擴(kuò)增對(duì)陽性克隆進(jìn)行篩選和鑒定，并將陽性菌液送至測(cè)序公司(昆明碩擎生物公司)測(cè)序。

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序得到的噬藻體g20基因序列經(jīng)NCBI Blast比對(duì)后，使用軟件Clastal對(duì)得到的噬藻體g20基因序列和g20基因參考序列進(jìn)行比對(duì)，使用軟件Mega7構(gòu)建g20基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳多樣性分析。筆者將獲得的g20基因序列標(biāo)注為“湖泊+季節(jié)+第幾條序列”，例如撫仙湖秋季序列的第3條標(biāo)注為“FXa-3”，星云湖冬季序列的第5條序列為“XYw-5”。獲得的序列已提交NCBI網(wǎng)站，其序列號(hào)為MW032215-MW032257。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同湖泊水樣中噬藻體g20基因PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

對(duì)滇池、星云湖和撫仙湖秋冬季濃縮水樣提取DNA，使用噬藻體g20基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在g20基因擴(kuò)增結(jié)果的600 bp位置處有明顯條帶(圖1)，與g20目的基因片段長(zhǎng)度相符。對(duì)PCR產(chǎn)物膠回收經(jīng)TA克隆篩選，以撫仙湖樣品g20基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(圖2)為例，不同湖泊g20基因菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果均在600 bp位置處有明顯條帶。將陽性菌液送至測(cè)序公司測(cè)序，得到43條g20基因環(huán)境序列，其中撫仙湖g20基因序列共21條(秋季7條，冬季14條)，滇池g20基因序列共14條(秋季7條，冬季7條)，星云湖g20基因序列共8條(秋季4條，冬季4條)。

2.2 不同湖泊水樣中噬藻體g20基因同源性分析

在 NCBI 網(wǎng)站上，基于核苷酸水平BLAST 比對(duì)結(jié)果可以看出，該研究獲得的 43 條g20基因環(huán)境序列與報(bào)道的其他環(huán)境來源的噬藻體g20序列的相似度為74%～100%(表1)。有22條g20基因序列與武漢東湖水體中噬藻體g20基因序列相似性最高，相似度為74%～98%，有8條g20基因序列與美國(guó)伊利湖水體中噬藻體g20基因序列相似性最高(83%～99%)，2條與新加坡克蘭芝水庫水體中噬藻體g20基因序列具有最高相似性(91%～92%)，3條g20基因序列與法國(guó)阿爾卑斯山湖泊水體中噬藻體g20基因序列具有最高相似性(92%～94%)，1條g20基因序列與日本稻田中噬藻體g20基因序列具有最高相似性(83%)，7條g20基因序列與滇池水體中噬藻體g20基因序列具有最高相似度(82%～100%)。滇池秋季的7條g20基因序列(DCa2-4、DCa5-7、DCa11)與已報(bào)道序列滇池水體克隆(OTU20SMay-M-1-98)、武漢東湖水體克隆(g20_DH07/2012_1、g20_DH07/2012_7)具有較高相似性(74%～100%)；滇池冬季的7條g20基因序列(DCw1、DCw3-4、DCw7、DCw11、DCw13-14)與已報(bào)道序列日本稻田水體克隆(PFW-CM13)、滇池水體克隆(OTU11NApr-XA-1-3)、武漢東湖水體克隆(g20_DH06/2012_18)具有較高相似性(76%～83%)。撫仙湖秋季的7條g20基因序列(FXa1-4、FXa6-8)與已報(bào)道序列美國(guó)伊利湖水體克隆(45202CPSCC14)、武漢東湖水體克隆(g20_DH10/2012_28)具有較高相似性(89%～99%)；撫仙湖冬季的14條g20基因序列(FXw3-6、FXw8-14、FXw16、FXw18-19)與已報(bào)道序列美國(guó)伊利湖水體克隆(45202CPSCC14)、武漢東湖水體克隆(g20_DH06/2012_18、g20_DH11/2012_25、g20_DH10/2012_28)、法國(guó)阿爾卑斯山湖泊水體克隆(LAB_g20_b30_A3)、新加坡克蘭芝水庫水體克隆(KRB0109M2、KRB1208M3)具有較高相似性(75%～99%)。星云湖秋季的4條g20基因序列(XYa1-2、XYa7-8)與已報(bào)道序列武漢東湖水體克隆(g20_DH09/2012_5、g20_DH06/2012_18、g20_DH04/2013_43)具有較高相似性(77%～98%)；星云湖冬季的4條g20基因序列(XYW1-2、XYW4、XYW12)與武漢東湖水體克隆(g20_DH06/2012_18、g20_DH04/2013_43)具有較高相似性(76%～78%)。

表1 云南不同高原湖泊g20基因與 NCBI 數(shù)據(jù)庫在核苷酸水平的同源性比較

2.3 不同湖泊水樣中噬藻體g20基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)從云南滇池、星云湖和撫仙湖獲得的43條噬藻體g20序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，所有序列可劃分成5個(gè)進(jìn)化簇(Cluster Ⅰ～Ⅴ)，Cluster Ⅰ包括7條撫仙湖g20序列和8條滇池g20序列；Cluster Ⅱ包括8條撫仙湖g20序列和4條滇池g20序列，1條星云湖g20序列；Cluster Ⅲ包括2條撫仙湖序列、2條星云湖序列和1條滇池序列；Cluster Ⅳ包括2條星云湖序列、1條撫仙湖序列和1條滇池序列；Cluster Ⅴ包括3條星云湖序列和3條撫仙湖序列。其中星云湖和撫仙湖噬藻體g20基因序列分布于多個(gè)進(jìn)化簇中(星云湖序列分布于ClusterⅡ～Ⅴ；撫仙湖序列為ClusterⅠ～Ⅴ)；滇池g20序列主要分布在ClusterⅠ～Ⅱ中。從季節(jié)上來看，滇池秋季g20序列分布在ClusterⅠ～Ⅲ中；撫仙湖秋季g20序列分布在ClusterⅠ、Ⅲ～Ⅴ中；星云湖秋季g20序列分布在Cluster Ⅲ～Ⅴ中。撫仙湖與星云湖分布趨勢(shì)大致相同，但撫仙湖秋季g20序列多樣性更顯著。滇池冬季g20序列分布在ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅳ中；撫仙湖冬季g20序列分布在ClusterⅠ、Ⅱ、Ⅴ中；星云湖冬季g20序列分布在ClusterⅡ、Ⅲ、Ⅴ中。

對(duì)該研究獲得的g20基因序列與已報(bào)道的其他湖泊中的噬藻體g20序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，可劃分為2個(gè)大簇(Cluster α、Cluster β)，云南高原3個(gè)湖泊水體中大部分g20基因序列分布在Cluster β，而其他湖泊包括武漢東湖、滇池、美國(guó)伊利湖、新加坡克蘭芝水庫和法國(guó)布爾熱湖等湖泊水體中g(shù)20基因序列分布在Cluster α，表明云南高原湖泊與其他不同湖泊環(huán)境中肌尾科噬藻體g20基因組成存在一定差異。

對(duì)該研究獲得的噬藻體g20基因序列和NCBI 數(shù)據(jù)庫中稻田、淡水和海洋噬藻體、未培養(yǎng)的噬藻體g20基因參考序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖5所示，所有序列被劃分成7個(gè)簇(Cluster A～G)。Cluster A 包括中國(guó)杞麓湖、科威特海洋沿岸、墨西哥灣海洋環(huán)境未培養(yǎng)噬藻體的g20序列和該研究得到的2條星云湖g20序列、8條滇池g20序列和8條撫仙湖g20序列，其中3條撫仙湖、星云湖g20序列單獨(dú)形成1個(gè)亞簇(A2)。

Cluster B包括汕頭沿海、美國(guó)佐治亞州薩凡納河口、大西洋薩加索海等海洋未培養(yǎng)的噬藻體g20序列以及滇池g20序列1條、撫仙湖g20序列2條、星云湖g20序列2條。Cluster C包括美國(guó)巴爾博亞島沿海海洋、俄羅斯貝加爾湖噬藻體g20序列和撫仙湖、星云湖g20序列各2條；Cluster D包括中國(guó)東湖未培養(yǎng)的噬藻體g20序列和該研究的5條滇池g20序列、1條星云湖序列和8條撫仙湖序列，其中DCw-1單獨(dú)形成1個(gè)分支，可能為新的基因型。Cluster E、F和G包括來自淡水湖、我國(guó)東北稻田、日本稻田及海洋水體的噬藻體g20序列類群。研究獲得的大部分序列分布于Cluster A～D(滇池g20序列分布于Cluster A～B、D，撫仙湖g20序列分布于Cluster A～D、G，星云湖g20序列分布于Cluster A～E)，與湖泊、海洋序列共處于不同進(jìn)化簇中，推測(cè)高原湖泊水體中肌尾科噬藻體的g20基因群集與海洋、湖泊環(huán)境中具有較近的親緣關(guān)系，但遠(yuǎn)離稻田水體g20序列的分布。從3個(gè)湖泊秋冬季采集水樣獲得的g20基因序列分布看，各湖泊秋冬季g20基因遺傳多樣性無明顯差異。

3 討論

根據(jù)噬藻體g20基因已設(shè)計(jì)出不同引物如CPS1/CPS2、CPS1/CPS4、CPS1/CPS8等，隨著對(duì)其引物的不斷優(yōu)化，利用g20基因已成功地對(duì)湖泊、稻田、近海海域、開闊海域及寡營(yíng)養(yǎng)海域等區(qū)域中肌尾科噬藻體基因多樣性進(jìn)行研究。通過分析g20基因不同的PCR擴(kuò)增引物，發(fā)現(xiàn)使用引物CPS1.1/CPS8.1獲得的g20基因源于噬藻體，尚不能利用該引物從其他噬菌體中獲得g20序列[12]。該研究采用CPS1.1/CPS8.1引物作為噬藻體g20基因的引物，分析高原湖泊肌尾科噬藻體g20基因多樣性。

撫仙湖、滇池和星云湖都屬于中國(guó)云南的高原淡水湖泊，由于所處地理位置的差異以及周圍人類活動(dòng)的不同，在對(duì)3個(gè)湖泊噬藻體g20基因序列多樣性研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，3個(gè)高原湖泊肌尾科噬藻體g20基因序列大部分與來自其他淡水湖泊、海洋生態(tài)系統(tǒng)的g20基因群集更為相似，與稻田水體中g(shù)20基因進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，可能存在一些海洋噬藻體與淡水噬藻體有共同的起源；而與其他淡水湖泊相比，云南高原湖泊肌尾科噬藻體g20基因組成存在一定差異(圖4)。ZHONG等[13]在安納西湖和布爾熱湖2個(gè)高原湖泊的研究發(fā)現(xiàn)，噬藻體g20序列與日本稻田和大西洋薩加索海的噬藻體g20序列同源性較高。DORIGO等[14]以g20基因CPS1/CPS8為引物研究法國(guó)布爾熱湖時(shí)，通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)所獲得的噬藻體g20基因序列部分與海洋g20基因序列關(guān)系較近，部分g20基因序列為淡水湖泊所特有。不同水域間噬藻體g20基因多樣性存在著一定差異，各自都有獨(dú)特的類群，這表明g20基因的分布與其存在的環(huán)境具有一定關(guān)系[15]。

不同水域環(huán)境中噬藻體g20基因組成存在差異，這與不同環(huán)境中噬藻體種類有關(guān)。從湖泊富營(yíng)養(yǎng)化程度來看，撫仙湖屬于貧營(yíng)養(yǎng)化湖泊，滇池和星云湖屬于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊，撫仙湖噬藻體g20基因序列表現(xiàn)出更為豐富的多樣性，而地理位置相近的星云湖噬藻體g20基因序列多樣性并沒有撫仙湖顯著，推測(cè)由于富營(yíng)養(yǎng)化的問題，貧營(yíng)養(yǎng)化的撫仙湖藍(lán)藻種類較星云湖豐富，宿主多樣性導(dǎo)致噬藻體g20基因多樣性更為豐富。與星云湖同為富營(yíng)養(yǎng)化湖泊的滇池噬藻體g20基因多樣性也較為單一，表明噬藻體基因多樣性與湖泊環(huán)境及其宿主多樣性有很大關(guān)系。以g20為遺傳標(biāo)記對(duì)海洋水體的研究發(fā)現(xiàn)，其宿主與浮游病毒的基因多樣性呈正相關(guān)[16]，水體中病毒與其宿主的豐度也呈正相關(guān)[17]，這說明撫仙湖藍(lán)藻種類比星云湖豐富，導(dǎo)致?lián)嵯珊稍弩wg20基因多樣性較其他2個(gè)湖泊更為豐富。

相比秋、冬兩季，撫仙湖、滇池和星云湖的g20基因序列多樣性差異并不顯著，可能是因?yàn)樵颇细咴?個(gè)湖泊相距較近，且秋冬季湖泊溫度差異不大，導(dǎo)致湖泊中藍(lán)藻種群變化較小，噬藻體g20基因序列多樣性差異并不顯著。噬藻體g20基因的時(shí)空變化表明它們的宿主藍(lán)藻群落也在湖泊中發(fā)生著時(shí)空變化。SANO等[18]報(bào)道了同一環(huán)境的海洋噬藻體可以感染不同環(huán)境中的宿主。WANG等[19]對(duì)于東北稻田噬藻體phoH基因獨(dú)特性分布的研究表明，噬藻體不受地理分布的限制。后續(xù)研究中，了解噬藻體群落與藍(lán)藻群落之間的聯(lián)系是必不可少的。

綜上所述，以g20基因作為分子標(biāo)記，采用PCR-克隆測(cè)序技術(shù)，對(duì)云南高原湖泊g20基因遺傳多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，滇池、撫仙湖和星云湖水體中存在著豐富的肌尾科噬藻體g20基因序列，存在新的噬藻體g20基因；3個(gè)湖泊中肌尾科噬藻體g20基因類群與其他淡水湖泊、海洋水體g20基因類群進(jìn)化距離較近，即親緣關(guān)系較近，與稻田水體中g(shù)20基因親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。秋冬季肌尾科噬藻體g20基因遺傳多樣性不明顯，貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的撫仙湖g20基因遺傳多樣性相對(duì)較為豐富。