蔡 芬,陳 偉

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

黃曲霉毒素是由常見的黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,其物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,難以用巴氏消毒法破壞[1]。黃曲霉毒素會污染動物飼料,使飼料霉變產(chǎn)生黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)。當(dāng)動物攝入后,黃曲霉毒素B1被羥基化成黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)并分泌到牛奶中[2-3]。AFM1非常需要被重視,因?yàn)樗Ｔ诖蠖鄶?shù)乳制品中被發(fā)現(xiàn)，并且具有高度致癌性,導(dǎo)致人類患肝癌[4]。

此外,AFM1被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer, IARC)歸類為Ⅰ類致癌物[5]。這意味著牛奶和其他乳制品可能含有對人類尤其是幼兒構(gòu)成威脅的AFM1,其可導(dǎo)致動物和人類的生長受損,乳制品質(zhì)量需要人們廣泛關(guān)注[6]。

根據(jù)報(bào)道,包括貝寧和肯尼亞在內(nèi)的一些國家,兒童生長受損和黃曲霉毒素暴露之間存在顯著關(guān)聯(lián)[7]。由于這些原因,歐盟(European Union, EU)No 165/2010的最新委員會條例規(guī)定了黃曲霉毒素監(jiān)管的嚴(yán)格參數(shù),牛奶中AFM1的最高質(zhì)量濃度[8]為0.05 mg/L。美國食品藥物管理局(Food ang Drug Administration, FDA)將牛奶中的AFM1和動物飼料中的總黃曲霉毒素的作用水平[9-10]分別設(shè)為0.5 mg/L和20 mg/kg。我國在2011 年就針對AFM1 制定了相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn),規(guī)定其在乳及乳制品和特殊膳食食品中的限量不得超過[11]0.5 μg/kg。

目前,常用于檢測牛奶中AFM1的方法主要有薄層色譜法(thinlayer chromatography,TLC)[12]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[13-15]、酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)[16]。前3種檢測方法存在檢測時(shí)間長、前處理復(fù)雜、檢測成本高、檢測工作依賴于昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員等缺點(diǎn)[17],同時(shí)ELISA 法為篩選法[18],易出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。并且上述4種檢測方法均需要進(jìn)行樣品的前處理,從而不利于基層的推廣[19]。因此,建立針對AFM1 的高靈敏度、快速、穩(wěn)定、易普及的檢測方法是非常有必要的。

本實(shí)驗(yàn)通過膠體金標(biāo)記免疫側(cè)向?qū)游鰹榛痉椒?進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化,避免了牛奶中脂肪、蛋白質(zhì)等基質(zhì)的影響,建立了一種簡單、快速定量牛奶中AFM1的檢測方法,實(shí)現(xiàn)了對牛奶中AFM1的快速痕量現(xiàn)場檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

99.9%黃曲霉毒素M1標(biāo)品(化學(xué)純)、檸檬酸三鈉(分析純)、酪蛋白(Casein)(純度>98%)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(純度>98%)均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter,NC膜)、玻璃纖維膜、吸水墊、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)底板均購于上海捷寧生物科技有限公司;氯金酸購于百靈威科技有限公司;羊抗鼠二抗、黃曲霉毒素人工抗原小鼠腹水單克隆抗體均由北京拜爾迪生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛科技公司),2802 UV/Vis紫外分光光度計(jì)(于山東寶萊科技股份有限公司),XYZ3000金標(biāo)點(diǎn)樣儀、CM4000金標(biāo)切條機(jī)(美國Bio-Dot公司),電子天平FA1104B(上海精天電子儀器有限公司),微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司),移液器(芬蘭雷勃公司),DHG-9109-25A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司),磁力加熱攪拌器RCT(廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備

本實(shí)驗(yàn)中所使用的膠體金采用檸檬酸三鈉還原法[20]制備。取250 mL錐形瓶使用雙蒸水沖洗干凈后,向瓶內(nèi)加入王水直至瓶頸在通風(fēng)櫥中浸泡至少24 h。王水充分浸泡后,將錐形瓶取出,用雙蒸水反復(fù)沖洗蒸煮3～5遍。向洗凈的250 mL錐形瓶中加入850 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的氯金酸溶液,加55 mL雙蒸水放于磁力攪拌器上加熱至微沸。當(dāng)錐形瓶中液體微沸后,維持1 500 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速不變,迅速加入一定體積的1%檸檬酸三鈉溶液。觀察溶液的顏色在2 min內(nèi)發(fā)生明顯變化,由透明黑紫酒紅,直至顏色不變后關(guān)閉熱源繼續(xù)攪拌10 min。冷卻至室溫后放在0～4 ℃條件下保存待用。

1.3.2 膠體金單克隆抗體復(fù)合物的制備

向經(jīng)過0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH值的1 mL膠體金中加入1 mg/mL AFM1單克隆抗體,混勻反應(yīng)1 h后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的牛血清白蛋白(BSA),混勻反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后,在4 ℃,9 500 r/min離心7 min,移去上清液,沉淀物用重懸液進(jìn)行重懸,即制成膠體金-AFM1單克隆抗體復(fù)合物濃縮液。

1.3.3 試紙條原料的預(yù)處理及其組裝

(1) 樣品墊預(yù)處理。將寬度為22 mm 玻璃纖維素膜在樣品墊預(yù)處理液中浸泡2 h后取，取出于37 ℃條件下烘干待用。

(2) 噴膜參數(shù)。將不同濃度的包抗原和羊抗鼠二抗用噴膜儀包被在NC膜上,形成間隔5 mm的檢測線(test line,T線)和質(zhì)控線(control line,C線),C線和T線噴膜速度均為0.5 μL/cm,37 ℃條件下烘干2 h,取出置于4 ℃避光干燥保存。

(3) AFM1檢測試紙條的組裝。將上述已處理過的樣品墊、NC膜、吸水墊按試紙條結(jié)構(gòu)分別粘貼在PVC底板上,用切條機(jī)切成3 mm寬的條狀,置于4 ℃避光干燥貯存。免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l結(jié)構(gòu)

1.3.4 試紙條條件優(yōu)化的評判標(biāo)準(zhǔn)

對試紙條條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí),對試紙條評判結(jié)果如下:若T線和C線處均出現(xiàn)紅色線條，則判定結(jié)果為陰性;若T線處出現(xiàn)淺紅色線條,同時(shí)C線出現(xiàn),則判定結(jié)果為弱陽性;若T線處未出現(xiàn)線條,而C線處出現(xiàn)紅色或淺紅色線條，則判定結(jié)果為陽性;C線處未出現(xiàn)線條,無論T線是否出現(xiàn)線條,均判定結(jié)果為檢測無效。

1.3.5 研發(fā)試紙條過程優(yōu)化

(1) 偶聯(lián)過程抗體添加量優(yōu)化。固定調(diào)節(jié)好一定pH值的膠體金,向其中加入不同量的抗體進(jìn)行偶聯(lián),設(shè)置梯度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 μL,上述5組金標(biāo)偶聯(lián)物經(jīng)重懸后進(jìn)行結(jié)果判定。取4 μL重懸液加入70 μL一定質(zhì)量濃度梯度的黃曲霉毒素M1樣品中對試紙條上樣,進(jìn)行結(jié)果分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

該優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中所用AFM1樣品均為用10%甲醇磷酸鹽緩沖液溶液的AFM1標(biāo)準(zhǔn)樣品液,樣品液質(zhì)量濃度梯度分別為0、0.5 μg/L。

(2) 偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH值優(yōu)化。 通過添加不同量的K2CO3對膠體金的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié),設(shè)置梯度為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μL,再向其中加入一定量的抗體進(jìn)行偶聯(lián),上述5組金標(biāo)偶聯(lián)物經(jīng)重懸后進(jìn)行結(jié)果判定。取4 μL重懸液混合于一定質(zhì)量濃度梯度的AFM1樣品中并對試紙條上樣,進(jìn)行結(jié)果分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

該優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中所用AFM1樣品均為用10%甲醇磷酸鹽緩沖液溶液的AFM1標(biāo)準(zhǔn)樣品液,樣品液質(zhì)量濃度梯度分別為0、0.5 μg/L。

(3) AFM1試紙條檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。所用AFM1樣品均為用10%甲醇磷酸鹽緩沖溶液的AFM1標(biāo)準(zhǔn)樣品液,樣品液質(zhì)量濃度梯度為0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L。取70 μL樣品與4 μL金標(biāo)偶聯(lián)物重懸液混合,放入溫育器溫育10 min,溫育后一起加入到試紙條的上樣區(qū),進(jìn)行檢測,每個(gè)質(zhì)量濃度做3 組平行實(shí)驗(yàn)。10 min后拍照,使用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。根據(jù)得到的數(shù)值建立劑量-反應(yīng)曲線確定線性范圍,建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

(4) 牛奶實(shí)際樣品中試紙條檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。從當(dāng)?shù)爻匈徣胄迈r牛奶經(jīng)液相色譜確證陰性后,取1 mL牛奶加入不同量的AFM1標(biāo)準(zhǔn)樣品使牛奶中AFM1添加量達(dá)到0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/L,編號為牛奶樣品1、2、3、4、5、6;取新鮮牛奶樣品為食品樣品7,作為空白對照。加入標(biāo)樣處理1 h后,可用于檢測;樣品檢測:在AFM1試紙條樣品墊上滴加樣品70 μL,反應(yīng)10 min后,讀取并判定結(jié)果。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

(5) 牛奶實(shí)際樣品中試紙條檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。應(yīng)用AFM1免疫層析試紙條分別對稀釋配制的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液(黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮)以及AFM1共5種毒素混合樣進(jìn)行檢測,AFM1質(zhì)量濃度設(shè)置為0.5 ng/mL,其他真菌毒素質(zhì)量濃度設(shè)置為5 ng/mL,判斷試紙條的特異性。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙條參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 抗體添加量對試紙條性能影響

抗體添加量對試紙條性能的影響見表1所列。

表1 抗體添加量對試紙條性能的影響

由表1可知,4組C線顯色強(qiáng)度穩(wěn)定,表明4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果均有效;而T線顯色程度隨著抗體添加量的增加而增加,顯色強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。當(dāng)抗體添加量為1.6 μL時(shí),其T線顯色強(qiáng)度數(shù)值接近5 000,遠(yuǎn)高于0.8、1.2 μL且接近2.0、2.4 μL強(qiáng)度。根據(jù)免疫層析試紙條檢測原理,0.8、1.2 μL的結(jié)果反映了加入抗體量較少,導(dǎo)致抗原未能充分和抗體結(jié)合,從而強(qiáng)度不高;而2.0、2.4 μL的抗體已處于過飽和狀態(tài),過量標(biāo)記過的抗體隨著毛細(xì)作用流向吸水墊。從經(jīng)濟(jì)性和有效性方面考慮,選擇1.6 μL為最佳抗體添加量。

2.1.2 偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH值對試紙條性能影響

偶聯(lián)過程偶聯(lián)pH值對試紙條性能影響如圖2所示。

從圖2可以看出,偶聯(lián)過程中加入K2CO3的量越大,T線越淺，由此可知偶聯(lián)過程中,反應(yīng)液堿性越強(qiáng),條帶顯現(xiàn)越弱。添加量為2.0 μL時(shí),試紙條條帶強(qiáng)度最大,但高濃度時(shí)不消線,原因極可能是K2CO3導(dǎo)致了非特異性吸附。添加量分別為4.0、5.0、6.0 μL時(shí),T線強(qiáng)度極弱,原因可能是堿性過強(qiáng),使抗體活性降低。綜合考慮,選擇3.0 μL為最優(yōu)添加量。

圖2 K2CO3添加量影響試紙條結(jié)果

2.2 AFM1試紙條檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)品中，AFM1試紙條檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。由圖3可知,AFM1 在用10%甲醇磷酸鹽緩沖液溶液的AFM1標(biāo)準(zhǔn)樣品液中的線性范圍為0.01～1.00 μg/L,檢測限為0.05 μg/L,對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為:

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品中靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線

y=71.36x-569.01,R2=0.939 9。

牛奶樣品中AFM1試紙條檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

從圖4可以看出,黃曲霉毒素B1 在牛奶樣品中線性范圍為0.01～1.00 μg/L,檢測限為0.05 μg/L,對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為:

圖4 牛奶樣品中靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線

y=105.95x-1 701.09,R2=0.984 6。

2.3 AFM1試紙條特異性驗(yàn)證

AFM1試紙條特異性如圖5所示。

圖5 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5c顯示除AFM1外,其他待檢物質(zhì)(黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN))均無法使T線消線,混合樣品可以使其消線,說明試紙條對AFM1具有很高的特異性;特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,其他待檢物質(zhì)化合物無法與AFM1單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng),不能干擾檢測結(jié)果,這種免疫層析檢測方法具有優(yōu)異的特異性。

3 結(jié) 論

目前,國內(nèi)牛奶受生物毒素、農(nóng)獸藥影響問題較多,社會各界也對這些問題廣泛關(guān)注[21]。但實(shí)際情況是現(xiàn)場執(zhí)行情況不盡人意,出現(xiàn)該問題的原因之一是受現(xiàn)有檢測手段的限制,不能現(xiàn)場快速檢測,簡單有效率地對執(zhí)法人員進(jìn)行指導(dǎo)[22]。

側(cè)向免疫層析具有不需要專用儀器、檢測速度快、操作簡單方便、可長期保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果、易于實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn),主要作為定性或半定量篩選檢測手段[23-24]。目前,側(cè)向免疫層析法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種毒素、生物大分子和抗生素的檢測[25]。文獻(xiàn)[26]成功建立了利用免疫層析試紙條對水中汞離子的快速超靈敏檢測方法。

本研究利用高特異AFM1試紙條單克隆抗體,建立了黃曲霉毒素免疫層析技術(shù),在此基礎(chǔ)上對牛奶實(shí)際樣品進(jìn)行測試,確證了牛奶基質(zhì)的檢測結(jié)果并無影響,實(shí)現(xiàn)了真正的牛奶樣品現(xiàn)場快速檢測。且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)表明,該檢測技術(shù)與HPLC檢測結(jié)果一致,滿足目前牛奶中黃曲霉毒素快速檢測技術(shù)的要求。

在最優(yōu)條件下,AFM1試紙條對AFM1的最低檢測限為0.05 μg/L,檢測時(shí)間為10 min。本方法作為一種快速篩查的手段,可以有效地防止AFM1中毒事件的發(fā)生,保護(hù)人們的身體健康,對于提升我國現(xiàn)場痕量檢測和食品監(jiān)測水平提供重要的技術(shù)參考。