胡詩余，施潔珺，胡濟安

NELL-1(neural epidermal growth factor-like 1)是一種促骨、軟骨分化的分泌性蛋白，在促進骨組織再生、軟骨組織修復(fù)方面研究廣泛，在組織工程方面有著巨大的應(yīng)用前景。目前經(jīng)典的成骨誘導因子BMPs(bone morphogenetic proteins)在應(yīng)用時具有脂肪生成、異位成骨、天然骨吸收等不良反應(yīng)[1]，而NELL-1特異性更強、副作用更少，與BMPs聯(lián)合應(yīng)用還能產(chǎn)生協(xié)同作用。下面對NELL-1促進骨形成和軟骨形成的研究進展進行綜述。

1 NELL-1蛋白的結(jié)構(gòu)特性和表達

在人類基因組計劃下，科學家分離出了NELL-1基因，發(fā)現(xiàn)其與一種雞神經(jīng)組織高度表達的基因nel有顯著同源性，兩者編碼的肽鏈均包含6個表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)樣序列[2]。隨后Ting等[3]在非綜合征性單側(cè)冠狀顱縫早閉(unilateral coronal synostosis，UCS)患者的顱縫周圍組織中發(fā)現(xiàn)了NELL-1蛋白表達上調(diào)，并猜測NELL-1基因優(yōu)先表達于顱骨膜內(nèi)骨和神經(jīng)組織。NELL-1蛋白包含幾個高度保守的功能域，包括1個分泌信號肽、1個NH2端血小板反應(yīng)蛋白-1樣(TSPN)模序、5個血管性血友病因子C(vWC)結(jié)構(gòu)域，以及6個EGF樣結(jié)構(gòu)域[2-5]。

這些年來，尋找NELL-1相關(guān)的細胞表面特異性受體一直是眾多學者的研究目標。接觸素相關(guān)蛋白樣4(contactin-associated protein-like 4，Cntnap4，也稱為Caspr4)是一種跨膜神經(jīng)毒素超家族受體，在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)認知中具有重要功能。Li等[6]發(fā)現(xiàn)，Cntnap4參與了NELL-1的誘導成骨，而且NELL-1和Cntnap4之間存在高親和力的配體/受體樣相互作用。在小鼠表達Wnt1的細胞中使Cntnap4特異失活，小鼠在新生兒期表現(xiàn)出了與NELL-1缺失小鼠非常相似的顱骨發(fā)育異常。以上結(jié)果表明NELL-1和Cntnap4在成骨過程中有一條生物學功能軸。值得注意的是：另有研究發(fā)現(xiàn)NELL-1與自閉癥、躁郁癥相關(guān)，NELL-1過表達可能會導致發(fā)育中的大腦神經(jīng)細胞大量凋亡，提示NELL-1可能在神經(jīng)系統(tǒng)中也有潛在的重要作用[6-8]。

NELL-1在所有骨性腫瘤中都有表達，與健康人的骨髓基質(zhì)細胞相比，骨肉瘤細胞系的NELL-1表達增多[9]。在所有軟骨相關(guān)腫瘤中，NELL-1表達也增多[10]。而且NELL-1表達水平與腫瘤種類和分級無關(guān)[9-10]。雖然NELL-1與腫瘤的關(guān)系密切，目前尚不能確認NELL-1究竟是促進腫瘤形成，還是僅僅作為腫瘤標記物存在。

2 NELL-1在成骨方面的調(diào)控作用

2.1 NELL-1促成骨分化與骨組織形成

最初有研究發(fā)現(xiàn)NELL-1能促進前成骨細胞的成骨分化，但是在成纖維細胞、成肌細胞中，單獨的NELL-1并不能誘導其向成骨細胞轉(zhuǎn)化[11-13]。除成骨細胞前體細胞外，NELL-1能明顯促進人原代脂肪來源的基質(zhì)細胞(human primary adipose-derived stromal cell，hASCs)的成骨分化，減少脂肪分化[14]。單獨的人類血管周干細胞(human perivascular stem cells，hPSCs)在非骨質(zhì)疏松模型中能促進大鼠的脊柱融合，而骨質(zhì)疏松大鼠中hPSCs的促成骨作用大幅下降，不過協(xié)同NELL-1能夠增強其成骨作用，明確了干細胞和NELL-1的組合可以促進骨質(zhì)疏松癥的骨生長[15-16]。還有研究發(fā)現(xiàn)NELL-1同種型NELL-1570能誘導小鼠間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化，顯著刺激MSCs增殖，并且NELL-1570對細胞增殖的誘導作用具有年齡依賴性，在成年小鼠細胞中表現(xiàn)出明顯的誘導作用，但在衰老小鼠細胞中卻沒有[17-18]。

此外，從嚙齒動物到非人類靈長類動物，從骨缺損模型、脊柱融合模型到骨質(zhì)疏松模型，大量的體內(nèi)研究證實了NELL-1應(yīng)用具有誘導骨再生能力，能夠明顯誘導動物的骨缺損愈合、脊柱融合、改善骨密度，同時抑制脂肪形成，而且NELL-1誘導的骨組織質(zhì)量與天然骨相似，在非人類靈長類腰椎脊柱融合模型中還有血管增加的現(xiàn)象[19-26]。

而另一方面，體外培養(yǎng)時下調(diào)NELL-1能抑制胎鼠顱骨(rat fetal calvarial，RFC)細胞和MC3T3細胞(一種成骨細胞前體細胞)的成骨分化[11]。NELL-1-單倍體不足小鼠經(jīng)歷增齡性的骨質(zhì)疏松癥，其特征是成骨細胞/破骨細胞減小和骨脆性增加[25]。ENU誘導的NELL-1基因缺失的小鼠骨骼系統(tǒng)發(fā)育異常，顱骨、頸椎、肋骨、長骨、頜骨都出現(xiàn)了畸形[27]。特異性失活小鼠Col2α1表達細胞的NELL-1(NELL-1Col2α1KO)，產(chǎn)后1和3個月，小鼠表現(xiàn)出侏儒癥和早期骨質(zhì)疏松癥[28]。小鼠Wnt1表達細胞的NELL-1特異性失活(NELL-1Wnt1KO)后，小鼠表現(xiàn)出明顯的額鼻和下頜骨缺損，另外有5.4%的年輕成年NELL-1Wnt1KO小鼠出現(xiàn)蝶骨內(nèi)軟骨結(jié)合過早骨化，額縫、矢狀縫和冠狀縫變寬[29]。缺乏NELL-1的顱神經(jīng)嵴細胞(cranial neural crest cells，CNCCs)細胞增殖和成骨分化的能力顯著降低，NELL-1對顱頂、顱底和下頜骨的正常發(fā)育和生長至關(guān)重要[29]。而且有臨床病例報告顯示：一個3歲的日本女孩身材矮小，相對大頭畸形，顱縫閉合延遲，11p14.1-p15.3缺失的基因包括了NELL-1，提示NELL-1在人類骨骼生長發(fā)育方面有非常重要的作用[6]。

2.2 NELL-1促成骨分化的調(diào)控機制

2.2.1 NELL-1與Runx2/Cbfa1 Runx2/Cbfa1是成骨細胞分化的主要調(diào)節(jié)因子，能誘導多潛能間充質(zhì)細胞分化為前成骨細胞，之后β-catenin、osterix和Runx2/Cbfa1使其向不成熟成骨細胞轉(zhuǎn)化，分泌骨基質(zhì)蛋白[30-32]。

一個骨特異性的cDNA芯片分析揭示，AdNELL-1轉(zhuǎn)導的MC3T3細胞在轉(zhuǎn)導12 d開始礦化時，很多成骨成軟骨基因存在明顯的表達差異，然而，Runx2、TGFβ-1、TGFβ-2、TGFβ-3等的RNA表達沒有區(qū)別，說明NELL-1可能是以上分子的下游基因[11]。Truong等[33]發(fā)現(xiàn)Runx2能與人類NELL-1基因啟動子中的3個功能性成骨細胞特異結(jié)合元件2(OSE2)結(jié)合，并反式激活NELL-1啟動子，上調(diào)NELL-1基因的表達。這些結(jié)果提示NELL-1可能為Runx2的下游靶點，而且可能對骨軟骨系分化的細胞有特異性作用。

同時，位于Runx2下游的Osterix對NELL-1的轉(zhuǎn)錄又存在抑制作用，能夠抑制RNA聚合酶Ⅱ與NELL-1基因的結(jié)合，這平衡了Runx2對NELL-1轉(zhuǎn)錄的促進作用[34]。

另外，Bokui等[35]發(fā)現(xiàn)NELL-1處理過的胎鼠顱骨(rat fetal calvarial，RFC)細胞內(nèi)ERK和JNK被磷酸化，從而激活Runx2使其被磷酸化，所以Runx2很可能也是NELL-1信號級聯(lián)反應(yīng)下游的一個轉(zhuǎn)錄因子，NELL-1通過促進其磷酸化來調(diào)節(jié)其活性，此時Runx2的磷酸化由ERK1/2介導(圖1)。NELL-1使Runx2磷酸化可能是一種反饋回路的體現(xiàn)，其目的在于細胞基因表達和功能的更精確調(diào)節(jié)。

2.2.2 NELL-1與MAPK信號通路 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑是將細胞外信號傳遞并轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)導通道之一[36]。MAPK信號通路包括ERK、JNK和P38激酶等通路，與成骨細胞分化的分子調(diào)控有密切關(guān)系。不依賴Smad的Ras-ERK/JNK信號通路主要參與了NELL-1介導的信號轉(zhuǎn)導[4，12-13，37]。對于多種有成骨分化能力的細胞，較低濃度的rhNELL-1蛋白能夠短時間激活Ras-MAPK信號級聯(lián)反應(yīng)，而RFC細胞中用siRNA介導Ras降解，隨后用NELL-1施加刺激，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的產(chǎn)生大量下降，Runx2磷酸化明顯減少，這可能是通過有效阻斷ERK的激活引起的[35]。另外，特異性JNK抑制劑能夠阻斷rhNELL-1誘導的Saos-2骨肉瘤細胞礦化，ERK1/2和P38抑制劑卻沒有這種效應(yīng)，因此，通過rhNELL-1介導Saos-2骨肉瘤細胞的終末成骨分化，必須激活JNK途徑[37]。

2.2.3 NELL-1與Wnt信號通路 James等[25]發(fā)現(xiàn)NELL-1通過與整合素β1相互作用，對Wnt/β-catenin信號傳導發(fā)揮正調(diào)節(jié)作用。有證據(jù)表明，在用NELL-1處理的MSCs中，β-catenin的核定位增加[38]。當Wnt信號傳導受到抑制時，NELL-1的成骨作用被破壞[39]。Chen等[29]發(fā)現(xiàn)，在NELL-1失活的小鼠CNCCs中，活性β-catenin的水平明顯較低，但通過外源性NELL-1蛋白處理，CNCCs成骨能力得以恢復(fù)至接近野生型細胞的水平，由此得出結(jié)論，NELL-1能夠激活Wnt/β-catenin通路，是CNCCs成骨的重要調(diào)節(jié)因子(圖1)。

2.2.4 NELL-1誘導成骨細胞凋亡 細胞凋亡是正常顱骨發(fā)育的一部分，并且對骨形成和骨吸收的平衡十分重要，所以凋亡異?？赡軙е嘛B縫的不成熟閉合(顱縫早閉)或者延遲閉合(顱鎖發(fā)育不全)[40]。NELL-1調(diào)節(jié)顱骨成骨細胞分化和凋亡，當其表達過度超生理水平時則會擾亂這些平衡，選擇性誘導具有礦化潛能的已分化成骨細胞凋亡，從而引起顱面發(fā)育異常[41]。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)過表達NELL-1，能導致顱蓋成骨細胞和神經(jīng)細胞的大量凋亡，從而誘導小鼠胚胎出現(xiàn)無顱畸形，而這種凋亡與Fas和Fas-L的產(chǎn)生增加有關(guān)。

圖1 NELL-1在成骨和成軟骨過程中的作用機制Fig.1 Mechanism of NELL-1 in osteogenesis and chondrogenesis

2.2.5 NELL-1對BMPs的協(xié)同作用 已知經(jīng)典的成骨誘導因子BMPs在應(yīng)用時具有脂肪生成、異位成骨、天然骨吸收、軟組織炎性腫脹等副作用，使臨床應(yīng)用陷入了一定困境[1]。但是當NELL-1與BMPs結(jié)合使用時，NELL-1可以逆轉(zhuǎn)BMPs的促脂肪作用，減弱BMP-2誘導產(chǎn)生的局部炎癥反應(yīng)，從而改善再生骨的質(zhì)量[42-43]。

最重要的是，NELL-1和BMP-2協(xié)同作用還能產(chǎn)生更強的促成骨效應(yīng)。Liu等[44]發(fā)現(xiàn)超低劑量的BMP-2與NELL-1在MSCs的成骨分化中具有協(xié)同作用，體外礦化作用更明顯。NELL-1和BMP-2聯(lián)合應(yīng)用相較BMP-2單獨作用，新生骨的骨皮質(zhì)和骨小梁更厚，骨強度更強，而且沒有明顯延伸至原來的骨缺損邊緣，顯著減小了組織體積[39]。目前推測，NELL-1和BMP-2在人類細胞中作用于成骨分化的不同階段，NELL-1相對作用于成骨階段后期，刺激骨祖細胞遷移、促進前成骨細胞分化，BMP-2促進骨骼干細胞分化[45]。

Wang等[46]使小鼠胚胎成纖維細胞(iMEF cells)過表達BMP-9、NELL-1或者使NELL-1基因沉默，發(fā)現(xiàn)BMP-9能夠調(diào)控NELL-1表達上調(diào)，反過來，NELL-1過表達能夠促進BMP-9誘導的晚期成骨分化，抑制早期的成骨標記物和成脂肪標記物表達。但是其研究中單獨過表達NELL-1并沒能引起明顯的成骨分化，這可能與實驗所用的iMEFs有關(guān)，一定程度印證了NELL-1在分化程度更高的前成骨細胞中更能引起明顯的骨化反應(yīng)。

2.2.6 NELL-1促成骨分化中的RNA網(wǎng)絡(luò) Huang等[47]利用RNA測序研究了NELL-1誘導hASCs成骨分化中circRNAs的表達譜，鑒定了兩個關(guān)鍵的circRNA，即circRFWD2和circINO80。這兩個circRNA在NELL-1誘導的成骨過程中被上調(diào)，而敲減它們會影響NELL-1對成骨的促進作用。Yu等[48]將rhNELL-1添加到成骨培養(yǎng)基中以激活hASCs的成骨分化，然后進行了高通量RNA測序，總共檢測到1 010個差異表達的miRNAs和1 762個差異表達的mRNAs，并構(gòu)建了lncRNAs/circRNAs-miRNAs網(wǎng)絡(luò)，以預(yù)測miRNAs的潛在調(diào)控作用。生物信息學分析表明，這些差異表達的miRNAs和mRNAs所富集的信號通路正是與成骨分化相關(guān)的重要通路。

3 NELL-1在骨組織再生方面的研究進展

3.1 NELL-1局部應(yīng)用

盡管少量的NELL-1就能夠起到骨誘導作用，但是溶液中游離的蛋白很容易由于肽鍵水解、聚合和擴散的原因而無法作用于局部，加上NELL-1蛋白的半衰期較短，所以為了應(yīng)用和儲存，研發(fā)更實用的NELL-1蛋白釋放系統(tǒng)很有必要。目前有多種骨誘導支架被研發(fā)成功，比如有羥基磷灰石涂層的聚乳酸-羥基乙酸共聚物盤、3D打印的生物活性玻璃塊/殼聚糖納米粒子(BD/CSn)復(fù)合物，作為支架裝載NELL-1，均能在體內(nèi)模型中修復(fù)骨缺損[21，49]?，F(xiàn)在有的支架還能做到控制蛋白釋放周期。殼聚糖/羥基磷灰石修飾的TCP顆粒和殼聚糖穩(wěn)定化的牛血清白蛋白納米顆粒能較好地控制NELL-1蛋白釋放，并可分別達到28 d和8 d的釋放周期[50-51]。聚電解質(zhì)復(fù)合物(polyelectrolyte complex, PEC)也能作為NELL-1和BMP-2的緩釋載體誘導成骨[44]。

3.2 NELL-1系統(tǒng)性用藥

骨質(zhì)疏松癥作為一種系統(tǒng)性疾病，局部給藥并不是一種理想的治療方案，系統(tǒng)性用藥的治療效果反而是最佳的。對于卵巢切除術(shù)后的骨質(zhì)疏松小鼠或NELL-1基因缺陷小鼠，通過小鼠尾靜脈注射NELL-1，均可以誘導明顯的骨形成[23，25]。然而，藥物的體內(nèi)半衰期和較快的清除速率往往會限制其使用。聚乙二醇化的NELL-1在保持NELL-1促成骨活性的基礎(chǔ)上，擁有更好的熱穩(wěn)定性和更長的體內(nèi)循環(huán)時間，降低了用藥頻率，可以滿足骨質(zhì)疏松癥的治療要求，而且靜脈注射和腹腔注射這兩種途徑均已得到體內(nèi)實驗的證實[52-54]。

除此之外，在小鼠骨折模型中，通過尾靜脈注射給藥的方式，治療組小鼠較對照組更早被觀察到纖維骨痂形成，骨折處骨密度增加更明顯，新生血管也更多，表明NELL-1的聚乙二醇化產(chǎn)物還有促進骨折愈合的作用[55]。

4 NELL-1在成軟骨方面的調(diào)控作用

NELL-1對于軟骨內(nèi)成骨的促進作用，似乎與軟骨發(fā)生是相悖的，但是NELL-1敲除不僅能導致成骨能力下降，還顯著性降低了軟骨相關(guān)基因的表達，抑制了軟骨細胞增殖和分化[27-28]。NELL-1基因缺失的小鼠存在椎間隙壓縮和頸椎曲度異常的頸椎缺陷，暗示NELL-1在椎間盤纖維軟骨的發(fā)育中有著特殊作用[27]。而NELL-1作用于軟骨細胞、hPSCs后，成軟骨標記物包括AGGRECAN、COLLAGENⅡ和COMP的mRNA表達水平均能上調(diào)[56-57]。另有體外研究發(fā)現(xiàn)在3D培養(yǎng)系統(tǒng)擴增兔軟骨細胞時，NELL-1能夠延長和維持軟骨表型，促進軟骨細胞增殖和特異性胞外基質(zhì)的沉積，且沒有礦化的胞外基質(zhì)產(chǎn)生，說明此時NELL-1幾乎沒有骨誘導作用[57]。體內(nèi)研究中，在兔股骨髁軟骨缺損模型植入NELL-1與殼聚糖納米顆粒/藻酸鹽凝膠載體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠形成接近天然軟骨的再生軟骨[58]。

如今，NELL-1如何正向調(diào)控軟骨形成的機制仍舊存在較多未知。Li等[59]證實了在成軟骨分化和軟骨成熟中，NELL-1是Runx2的關(guān)鍵下游靶點，但不像在成骨時NELL-1和Runx2互相有調(diào)節(jié)作用，軟骨形成過程中，NELL-1對Runx2的表達沒有影響。盡管NELL-1的表達很大程度上依賴于Runx2，在Runx2缺失的情況下，NELL-1促軟骨形成的功能仍舊部分保留。隨后，研究證明NELL-1的促軟骨形成活性主要依賴于Runx3介導的Ihh信號轉(zhuǎn)導[60]。T細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，Nfatc1)是介導軟骨細胞中的NELL-1→Runx3信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵因子，可以與Runx3啟動子結(jié)合，揭示了NELL-1→Nfatc1→Runx3→Ihh級聯(lián)反應(yīng)[61](圖1)。

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種導致軟骨破壞的炎性疾病，現(xiàn)在對于恢復(fù)病變關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能有著較大的需求。在OA狀態(tài)下的顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)注射NELL-1蛋白，注射12周后Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖mRNA的表達明顯高于對照組，提示NELL-1能一定程度上延緩骨關(guān)節(jié)炎的破壞[62]。Li等[63]發(fā)現(xiàn)NELL-1單倍體不足(NELL-1+/6R)小鼠在OA模型中，骨關(guān)節(jié)炎進展加速且更為嚴重。值得注意的是，化學誘導OA模型中，NELL-1明顯抑制了IL-1β刺激產(chǎn)生的炎癥及對關(guān)節(jié)軟骨的損害。從機制上講，除了其促軟骨形成潛力外，NELL-1還通過上調(diào)軟骨細胞中的Runx1來有效抑制炎癥細胞因子及其下游軟骨分解代謝酶的表達[63]。因此，對于OA來說，NELL-1有望成為一種具有促軟骨形成、消炎雙功能的緩解疾病的候選藥物。

5 NELL-1應(yīng)用于軟骨組織再生研究進展

利用MSCs進行軟骨修復(fù)必須解決兩方面問題，一是使細胞向軟骨細胞方向分化，二是重建新生的胞外基質(zhì)。Li等[56]用細胞團塊法培養(yǎng)hPSCs，并加入不同生長因子以期達到軟骨再生，結(jié)果NELL-1+TGF-β3+BMP-6的組合相比于TGF-β3+BMP-6能更快地促進hPSCs的成軟骨分化，還能避免軟骨肥大、纖維化、礦化等常見的副作用。此外，含NELL-1的藻酸鹽水凝膠也能明顯促進兔股骨髁軟骨的缺損愈合[58]。

正如前文提到的，由于較短的半衰期和較快的降解速率，直接應(yīng)用NELL-1蛋白不夠有效，但殼聚糖微顆?？梢猿掷m(xù)釋放NELL-1，以使NELL-1的成軟骨潛能發(fā)揮最大化[57-58]。

6 展 望

NELL-1作為一種具有特異性誘導成骨和成軟骨的細胞因子，相較于經(jīng)典的成骨誘導因子BMP2，安全性更高、副作用更少，在組織工程的應(yīng)用領(lǐng)域有非?？捎^的遠景。目前已有很多研究證實了NELL-1在骨/軟骨缺損、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎方面的治療潛力，但是對于NELL-1誘導軟骨形成的機制研究尚處于起步階段，我們期待在成軟骨領(lǐng)域能有更多的研究發(fā)現(xiàn)。而作為組織再生領(lǐng)域的新星，NELL-1在應(yīng)用中是否有促腫瘤形成的危險性，也需要研究者進一步的關(guān)注。另外，近年來有研究提示NELL-1在神經(jīng)系統(tǒng)中可能存在重要作用，探索NELL-1在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機理將是未來大有意義的研究方向。