于曉麗　陳超妍　吳雪寧　時云龍　劉超　劉振寧

摘 要 ABCB/PGP蛋白為ABC轉(zhuǎn)運蛋白的一個亞家族，能夠參與植物中生長素的極性運輸，在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用。為深入認識大白菜ABCB/PGP基因家族，利用生物信息學方法對大白菜中ABCB/PGP基因家族成員進行了全基因組水平鑒定，并對其基因組信息、蛋白質(zhì)生理生化特征、基因結構和系統(tǒng)進化等方面進行研究。結果表明，大白菜基因組中共鑒定到31個ABCB/PGP基因，這些基因在大白菜的10條染色體上分布不均，其中第3、4、6、7和9號染色體上分布有較多的家族成員。外顯子-內(nèi)含子基因結構分析表明，大部分ABCB/PGP基因都具有4～13個外顯子。亞細胞定位預測分析發(fā)現(xiàn)，ABCB/PGP蛋白多數(shù)定位在細胞質(zhì)膜上。進一步的系統(tǒng)進化分析表明，大白菜ABCB/PGP基因被聚類成6個分支，分別為CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ、CladeⅣ、CladeⅤ和CladeⅥ。上述研究結果為大白菜ABCB/PGP基因功能的研究奠定了一定的基礎。

關鍵詞 大白菜;ABC轉(zhuǎn)運蛋白;基因家族;生物信息學

中圖分類號：S634.1 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.06.001

植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白又稱ATP結合盒式轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC transporters），其廣泛存在于真核生物和原核生物中，是目前已知功能多樣、種類繁多的蛋白家族[1]。其中ABCB蛋白為ABC轉(zhuǎn)運蛋白的一個亞家族，又稱為多藥物抗性蛋白（Multidrug Resistance，MDR）或p-糖蛋白（p-glycoprotein，PGP）。在植物中研究發(fā)現(xiàn)，ABCB/PGP蛋白家族主要參與生長素的極性運輸[2]。另有研究表明，ABCB/PGP蛋白參與了植物細胞的木質(zhì)化進程以及鐵的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡[3-4]。目前，研究人員已經(jīng)對擬南芥、水稻、玉米、高粱、楊樹、桃、卷柏和小立碗蘚等植物中的ABCB/PGP基因家族進行了全基因組水平上的鑒定與分析。大白菜是我國的特色蔬菜之一，栽培面積和消費量在我國各類蔬菜中排行前列。大白菜全基因組測序的完成使得對大白菜相關基因家族的鑒定與分析成為可能。

本研究利用擬南芥ABCB/PGP氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組中進行搜索比對，鑒定出大白菜中ABCB/PGP基因家族成員，并結合系統(tǒng)進化樹分析ABCB/PGP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分類，以期為進一步研究大白菜ABCB/PGP基因的生物學功能奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 大白菜ABCB/PGP基因家族的鑒定

以擬南芥ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列作為種子序列在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadb.org/brad/）中通過BLAST P進行第一次比對搜索，找出候選基因。為了防止候選基因存在遺漏，再在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫進行了二次BLAST P比對搜索，保證最后數(shù)據(jù)的完整性。最后，利用Pfam數(shù)據(jù)庫、SMART數(shù)據(jù)庫和NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫分析候選蛋白的結構域，根據(jù)其結構域的有無鑒定是否屬于該基因家族。

1.2 大白菜ABCB/PGP基因的基因組信息和染色體定位

通過大白菜基因組數(shù)據(jù)庫獲得大白菜ABCB/PGP基因的序列和基因組信息，并根據(jù)每一個ABCB/PGP基因在染色體上的精確位置和染色體的長度使用Photoshop軟件將ABCB/PGP基因人工定位到對應的染色體上。大白菜ABCB/PGP蛋白的分子量和等電點通過進行在線分析。

1.3 大白菜ABCB/PGP基因的結構分析、保守域分析和進化樹分析

ABCB/PGP基因的外顯子-內(nèi)含子的結構圖使用GSDS在線軟件繪制。關于進化樹的構建，使用MEGA 5.0軟件自帶的Clustal W應用對蛋白的氨基酸序列進行比對分析，空格罰分設置為10，空格擴展罰分設置為0.2。然后將比對好的序列利用MEGA 5.0軟件構建進化樹，進化樹使用鄰接法構建，采用泊松校正，成對刪除和1 000次重復等建樹參數(shù)然后將比對好的序列構成進化樹。

2 結果與分析

2.1 大白菜ABCB/PGP基因家族的鑒定和注釋

根據(jù)擬南芥ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列，在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫中搜索比對，在大白菜中鑒定到31個ABCB/PGP蛋白，同時參考擬南芥ABCB/PGP基因命名的方法對大白菜ABCB/PGP基因進行了命名，見表1。31個ABCB/PGP基因的開放閱讀框長度在442～4 249 bp，

編碼147～1 416個氨基酸，相應的蛋白分子量在24.6～332.1 kDa，等電點在4.76～9.48。大部分ABCB/PGP基因都定位在細胞質(zhì)膜上。對大白菜ABCB/PGP基因染色體定位的分析表明，ABCB/PGP基因在大白菜的10條染色體上分布不是很均勻，其中第3、4、6、7和9號染色體上較多，而第1、2、5、8和10號染色體上的ABCB/PGP基因則比較少，僅有一兩個分布其上，如圖1所示。

2.2 大白菜ABCB/PGP基因的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

為分析大白菜ABCB/PGP基因的系統(tǒng)發(fā)育和分類，選取了大白菜、擬南芥這兩個代表性物種中ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列，使用MEGA 5.0軟件構建了NJ進化樹并對ABCB/PGP基因進行了聚類分析，結果如圖2所示。結果表明，這2個物種中的52個ABCB/PGP基因被聚類成6個分支，分支為CladeⅠ、CladeⅡ、CladeⅢ、CladeⅣ、CladeⅤ和CladeⅥ。從進化樹中可以看出每個分支都含有擬南芥ABCB/PGP基因與大白菜ABCB/PGP基因，分布比較均勻。其中CladeⅠ分支是基因分布最多的，在CladeⅠ分支中含有9個大白菜ABCB/PGP基因，分別為BrABCB1～BrABCB9，而擬南芥ABCB/PGP基因含有8個，分別為AtPGP3、AtPGP4、AtPGP5、AtPGP7、AtPGP9、AtPGP11、AtPGP12、AtPGP21;分支CladeⅤ是分布最少的，其中大白菜ABCB/PGP基因含有2個，為BrABCB25和BrABCB26，擬南芥ABCB/PGP基因也含有2個，分別為AtPGP13和AtPGP14。其他的CladeⅡ分支含有大白菜ABCB/PGP基因9個，含有擬南芥ABCB/PGP基因4個;CladeⅢ分支含有大白菜ABCB/PGP基因3個，而含有擬南芥ABCB/PGP基因2個;CladeⅣ分支中含有大白菜ABCB/PGP基因4個，擬南芥ABCB/PGP基因2個;CladeⅥ分支含有大白菜ABCB/PGP基因5個，擬南芥ABCB/PGP基因也是2個。

為進一步研究大白菜ABCB/PGP基因在植物中的進化模式，選用了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹、小立碗蘚、卷柏和桃這8個代表性物種中的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列使用MEGA5.0軟件構建了進化樹并對各物種中ABCB/PGP基因進行了聚類分析，結果如圖3所示。結果表明，這8個物種的ABCB/PGP基因被聚類成7個分支，多了一個分支CladeⅦ。其中CladeⅠ～Ⅵ每個分支都有分布各個物種的基因，而CladeⅦ分支上沒有大白菜和擬南芥的基因分布。

2.3 大白菜ABCB/PGP基因的基因結構分析

為研究大白菜ABCB/PGP基因的基因結構，根據(jù)大白菜基因組信息獲取了每一個ABCB/PGP基因的DNA和CDS序列信息并構建了其基因結構圖（圖4），結果表明大部分ABCB/PGP基因都有4～13個不等的外顯子且各分支分布相對比較均勻，只有其中部分小分支如BrABCB24、BrABCB31分布較少只有1～2個。同時，大部分ABCB/PGP基因都含有3～12個不等的內(nèi)含子，其中BrABCB24有1個內(nèi)含子，而BrABCB31則沒有內(nèi)含子。

3 討論與結論

本研究在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定到了31個ABCB/PGP基因家族成員，該家族是一個成員數(shù)目相對較多的家族。Gao等通過大白菜基因組數(shù)據(jù)庫對生長素運輸相關的3個蛋白家族成員（AUX/LAX、PIN和ABCB/MDR/PGP）進行了鑒定，其中篩選到27個ABCB/PGP基因家族成員，比本研究中鑒定到的基因家族成員少4個，分別為Bra025328、Bra039056、Bra027825和Bra033064[5]。但是需要注意的是，Bra027825和Bra033064這兩個基因的開放閱讀框長度跟其他ABCB/PGP基因家族成員相比較小，筆者推測這兩個基因可能是假基因或者沒有拼接出全長序列。

本研究首先選取了大白菜和擬南芥2個物種的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹，52個ABCB/PGP基因被聚類成6個分支，即CladeⅠ～CladeⅥ，然后進一步選取了大白菜、擬南芥、水稻、玉米、楊樹、小立碗蘚、卷柏和桃8個代表性物種中的ABCB/PGP蛋白的氨基酸序列進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)這8個物種的ABCB/PGP基因被聚類成7個分支，多了一個分支CladeⅦ，而CladeⅦ分支上均沒有大白菜和擬南芥的基因分布。大白菜ABCB/PGP基因在CladeⅦ的缺失原因仍有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 朱璐，許杰，張大兵.擬南芥ABC轉(zhuǎn)運類蛋白家族的分子進化、表達模式和蛋白功能網(wǎng)絡預測分析[J].植物生理學報，2012，48（12）：1151-1166.

[2] GEISLER M，BLAKESLEE JJ，BOUCHARD R，et al.

Cellular efflux of auxin catalyzed by the Arabidopsis MDR/PGP transporter AtPGP1[J].Plant Journal，2005，44（02）：179-194.

[3] KANEDA M，SCHUETA M，LIN BS，et al. ABC transporters coordinately expressed during lignification of Arabidopsis stems include a set of ABCBs associated with auxin transport[J].Journal of Experimental Botany，2011，62（06）：2063-2077.

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[5] GAO LW，LYU SW，TANG J，et al.Genome-wide analysis of auxin transport genes identifies the hormone responsive patterns associated with leafy head formation in Chinese cabbage[J].Scientific Reports，2017，7：42229.

（責任編輯：趙中正）