張元元 李旭 廖子君 王玉珍

摘要 目的：運用網絡藥理學的方法，探討苦參治療肝癌的作用機制。方法：通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數據庫分析平臺（TCMSP）篩選出苦參活性成分及作用靶點;在OMIM和Genecards中獲取疾病靶點。通過R語言對基因進行匹配并繪制韋恩圖;在String網站構建活性成分-蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖;Cytoscape 3.6.1軟件構建成分-靶點網絡;通過R軟件進行GO富集分析和KEGG通路富集分析。結果：共篩選出45個活性成分和176個潛在作用靶點;GO及KEGG功能富集顯示苦參主要影響PI3K/Akt/mTOR通路及HIF-1a等信號通路。結論：苦參可能通過影響PI3K/Akt/mTOR通路及HIF-1a等信號通路，從而調控肝癌細胞侵襲及轉移。

關鍵詞 網絡藥理學;苦參;肝癌;機制;活性成分;靶點;富集分析;信號通路

Molecular Mechanism of Sophora Flavescens in the Treatment of Liver Cancer Based on Network Pharmacology

ZHANG Yuanyuan1，2，LI Xu2，LIAO Zijun2，WANG Yuzhen2

（1 Graduate Department，Xi′an Medical College，Xi′an 710068，China; 2 First Department

of Internal Medicine，Shaanxi Cancer Hospital，Xi′an 710061，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of Sophora flavescens in the treatment of liver cancer by means of network pharmacology.Methods：First，the active ingredients and targets of Sophora flavescens were screened through the TCMSP platform; then the disease targets were obtained from OMIM and Genecards.We matched genes through R language and draw a Venn diagram; then constructed an active ingredient-protein interaction network diagram on the String website; constructed a component-target network with Cytoscape 3.6.1 software; performed GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis through R software.Results：A total of 45 active ingredients and 176 potential targets were screened; GO and KEGG function enrichment showed that Sophora flavescens mainly affected PI3K/Akt/mTOR pathway and HIF-1a signal pathways.Conclusion：Sophora flavescens may regulate the invasion and metastasis of liver cancer cells by affecting the PI3K/Akt/mTOR pathway and HIF-1a signaling pathways.

Keywords Network pharmacology; Sophora flavescens; Liver cancer; Mechanism; Active ingredients; Target; Enrichment analysis; Signal pathway

中圖分類號：R282;R735.7文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.05.013

肝癌發(fā)病率在所有惡性腫瘤中居于第6位，死亡率居第3位[1]。原發(fā)性肝癌屬“積聚”范疇，對于本病的治療側重于補虛祛瘀、活血化瘀通絡[2]。復方苦參注射液為臨床常用輔助治療肝癌藥物。中醫(yī)認為苦參主心腹結氣，歸肝膽經，而苦參具有軟堅散結、止痛解郁、增強免疫功能等功效[3]。研究證實苦參成分中的苦參堿等活性成分具有抗肝癌細胞侵襲、遷移的作用[4]。本研究應用網絡藥理學的方法預測苦參治療肝癌的多靶標及多通路的協同作用，進一步為肝癌的臨床及相關基礎研究提供參考?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 參芪扶正注射液化學成分的收集及靶點預測 在中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學數據庫分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）中輸入苦參進行成分與對應靶點的查詢以及篩選每味中藥可靠的成分信息。選擇標準：口服利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18。

1.2 活性化合物作用靶點的收集 利用TCMSP輸入苦參進行檢索并整理，獲得活性化合物作用靶點?；衔?靶點網絡的構建及拓撲學性質分析，利用Cytoscape 3.6.1軟件（http：//www.cytoscape.org/）將收集的中藥化合物和靶點來構建化合物-靶點網絡。在該網絡中篩選自由度（Degree Centrality，DC）為0.9的節(jié)點和相應的介數（Closeness Centrality，CC）進行拓撲分析，以明確關鍵的化合物或者靶點。

1.3 交集靶點的獲取 在genecard（https：//genecard.org/）數據庫、OMIM數據庫（http：//omim.org/）、GAD數據庫（https：//geneticassociationdb.nih.gov/），利用“l(fā)iver cancer”和“Hepatocellular Carcinoma”作為關鍵詞進行已知疾病靶點的檢索及篩查，刪除重復靶點以獲得已知靶點。利用R語言繪制將藥物活性成分相關的靶點和疾病靶點進行匹配映射，并繪制維恩（Venn）圖獲得苦參活性成分的潛在抗肝癌作用靶點。

1.4 構建苦參靶點蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡 將活性成分所對應的靶點基因和肝癌相關的靶點基因進行匹配，獲得二者的共同基因即為苦參抗肝癌的關鍵靶點。采用Cytoscape 3.6.1軟件構建“藥物-共活性成分-關鍵靶點基因”關系網絡。網絡外圍節(jié)點代表疾病與藥物活性成分的關鍵靶點基因;網絡中顯示的是藥物的活性成分。整個網絡展示藥物-共活性成分-疾病靶點之間的聯系，通過構建這一網絡探析治療肝癌的作用機制。

1.5 關鍵靶點蛋白質-蛋白質相互作用網絡的構建? 利用STRING數據庫平臺（https：//string-db.org/Version 10.5）預測蛋白相互作用關系。將苦參作用關鍵靶點導入String數據庫，將研究物種為選擇為人類（Human Sapiens），獲得蛋白質相互作用關系，將結果以TSV格式導出。其中淺藍色的線代表從數據庫中的來的蛋白間作用，紫色線代表經過實驗驗證的蛋白間作用。

1.6 基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析與基因相互作用KEGG通路富集分析 利用R語言對獲得的基因進行GO富集分析和KEGG通路分析。首先在R中進行安裝包的安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將苦參治療肝癌的關鍵靶基因轉換成entrezID以進行關鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析（P<0.05，FDR<0.05），并將結果以條形圖形式輸出。

2 結果

2.1 苦參活性成分和靶基因 通過TCMSP數據庫檢索的苦參化學成分126個，通過口服利用度（OB）>30%和類比性（DL）>0.18進一步篩選得到苦參的潛在活性成分45個。見表1。

2.2 肝癌相關基因 在GeneCards數據庫、OMIM數據庫和GAD數據庫，檢索“Liver Cancer”“Hepatocellular Carcinoma”，共篩選出15 396個肝癌相關基因，然后分別與苦參對應的靶基因映射，得到176個苦參活性成分治療肝癌的靶基因。見圖1。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建與分析 苦參與肝癌作用靶點相關的藥物的潛在活性成分有23個。將苦參與肝癌相關的關鍵靶點基因導入Cytoscape軟件進行網絡構建及可視化（圖2）。結果表明，苦參中連接度為前5的潛在活性分子為槲皮素（Quercetin），大豆素（Daidzein），芒柄花素（Formononetin），8-Isopentenyl-kaempferol，（2S）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-5-methoxy-8-（3-methylbut-2-enyl）chroman-4-one。以上成分對肝癌的治療有著重要意義。

2.4 共表達網絡的構建 將原發(fā)性肝癌治療的潛在的關鍵靶點基因導入String數據庫平臺，選擇物種為人類，獲取蛋白質相互作用關系，利用該平臺繪制蛋白關系網絡（圖3）。排除游離的（無相互作用蛋白），該網絡圖共包括45個節(jié)點，288個邊。用節(jié)點的大小和顏色表示Degree值的大小，節(jié)點越大對應的Degree值越大，顏色由紅變藍對應的Degree值越大。用邊的粗細表示Combine score值的大小，邊越粗Combine score值越大。根據Degree≥10的節(jié)點制作出前7個關鍵蛋白質節(jié)點（圖4）。關鍵節(jié)點為JUN、RELA、MAPK1、MAPK14、AKT1、ESRI、RB1這些靶點基因在治療肝癌治療中具有重要意義，可作為藥對參芪扶正注射液有效成分作用的靶點基因。

2.5 GO功能富集分析 通過關鍵靶基因，根據校正后P值進行排序，選擇前20個進行條形圖展示。見圖5。苦參主要參與核受體功能、轉聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特錄因子活性、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性脫氧核糖核酸（DNA）結合轉錄激活因子活性和核糖核酸（RNA）聚合酶Ⅱ特異性、RNA異性DNA結合、泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、近端啟動子DNA結合轉錄激活因子活性、激素結合、激酶調節(jié)活性、四吡咯結合、固醇類激素結合、核激素受體結合等。

2.6 KEGG通路富集分析 關鍵靶基因與KEGG通路進行映射，根據校正后P值進行排序，選擇前20個進行條形圖展示。見圖6。苦參治療肝癌的信號通路包括人巨細胞病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖、糖尿病中的AGE-REGE信號通路、內分泌抵抗、白細胞介素-7（IL-7）、腫瘤壞死因子（TNF），P53，缺氧誘導因子-1a（HIF-1a）等信號通路，還包括非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌等與癌癥相關的信號通路。

3 討論

苦參具有抗腫瘤、輔助放化療增敏、提高免疫力、緩解癌性疼痛等功效[5]。本研究通過TCMSP數據庫獲得苦參活性成分并進一步分析獲得其活性成分，通過GeneCards數據庫、OMIM數據庫和GAD數據庫，獲得肝癌相關基因，通過Cytoscape軟件進行“藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建與分析苦參中位于前5位的潛在活性分子，然后通過String數據庫進行共表達網絡構建獲取關鍵靶基因，最后進行GO及KEGG功能富集分析分析其相關信號通路。馬云青等[6]研究表明槲皮素能夠抑制腫瘤細胞分裂增殖，誘導腫瘤細胞的凋亡，尤其對肝癌細胞具有很強的抑制能力。Tan等[7]發(fā)現槲皮素能使下調肝癌細胞組織中的凋亡抑制基因Survivin和Bcl-2蛋白的表達，同時上調P53蛋白的水平。張蕾等[8]對經過刺芒柄花素的67例老年晚期肺癌患者胸水及血清中血清基質金屬蛋白酶（MMP-2）、E選擇素（ES）、血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等指標及腫瘤標志物進行分析，發(fā)現該藥治療后患者胸水及血清中上述指標明顯降低。Ye等[9]研究表明，芒柄花素能夠抑制前列腺癌LNCa P細胞和PC-3細胞增殖，同時也可使LNCa P細胞凋亡。目前對于（2S）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-5-methoxy-8-（3-methylbut-2-enyl）

chroman-4-one的研究還尚未見報道，而本研究表明該活性成分是苦參發(fā)生作用的關鍵活性成分。因此這些活性成分的藥理作用有必要深入研究，以便于進一步為臨床提供指導。

本研究發(fā)現苦參對肝癌發(fā)揮治療作用的7個關鍵靶點節(jié)點為JUN、RELA、MAPK1、MAPK14、AKT1、ESRI、RB1。Wang等[10]研究發(fā)現JNK/c-Jun/AP-1信號通路的激活能使mdr1的表達水平升高，從而介導了5-氟尿嘧啶耐藥Bel-7402/FU人肝癌細胞的耐藥。也有研究表明c-Jun能通過對β3GnT8的調控作用發(fā)揮對肝癌細胞侵襲、遷移調控的作用機制[11]。而本研究表明JUN基因是苦參對肝癌發(fā)揮治療作用的一個關鍵靶點，但目前關于苦參通過調控JUN基因來調節(jié)肝癌細胞侵襲和遷移的作用機制尚未有研究報道，因此可做進一步研究。既往有研究表明MAPK的激活導致了肝癌的遷移、侵襲和轉移等惡性生物學行為[12]。MAPK1磷酸化并作用于下游蛋白后會使細胞周期從G1期進入S期[13]。目前有研究報道苦參素可能通過對MAPK信號通路的調控發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖的作用[14]，進一步驗證了本研究的正確性。本研究發(fā)現MAPK14也是苦參作用的關鍵靶點，但關于苦參通過調控MAPK14基因來抑制肝癌細胞增殖的研究目前還尚未見報道，有必要對其深入研究。有研究報道過表達HBx既能促進肝癌細胞增殖也能上調PI3K和AKT的表達[15]，而AKT蛋白激活后會激活下游通路，促進底物水平的磷酸化，發(fā)揮抑制細胞凋亡的作用[16]。郭浩等[17]研究發(fā)現，苦參堿可能通過調控PI3K/Akt/mTOR通路從而促進肝癌細胞自噬，但具體機制尚不十分清楚。本研究證實AKT是苦參作用的關鍵靶點。ESR1屬于雌激素受體，通過與其配體結合發(fā)揮作用。既往研究表明ESR1多態(tài)性導致肝癌發(fā)病風險的增加[18]。但目前關于苦參通過調控ESR1基因來影響肝癌發(fā)生發(fā)展的報道尚未見報道，因此可深入研究。本研究發(fā)現核心基因的GO功能富集主要集中在核受體功能、轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性脫氧核糖核酸（DNA）結合轉錄激活因子活性和核糖核酸（RNA）聚合酶Ⅱ特異性、RNA聚合酶Ⅱ近端啟動子序列特異性DNA結合、泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、近端啟動子DNA結合轉錄激活因子活性、激素結合、激酶調節(jié)活性、四吡咯結合、固醇類激素結合、核激素受體結合等，這些基本生物學過程和功能體現在苦參活性成分調節(jié)對應靶基因和具體通路過程中。關于KEGG通路富集，主要包括人巨細胞病毒感染、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、糖尿病中的AGE-REGE信號通路、癌癥中的蛋白多糖、內分泌抵抗、白細胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子（TNF），P53，缺氧誘導因子-1a（HIF-1a）等信號通路，還包括非小細胞肺癌、小細胞肺癌、前列腺癌、膀胱癌等其他腫瘤相關信號通路。分析其富集通路可知，苦參主要通過改變腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤細胞的轉移及促進腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮治療肝癌的作用。有研究報道抑制MAPK信號通路后可以減低AML復發(fā)的風險[19]。而我們的研究也證實了MAPK是苦參作用的關鍵靶點，而巨細胞病毒感染也是肝癌發(fā)展的危險因素，但目前關于此的研究尚未見報道。研究表明低流體剪切應力與動脈粥樣硬化存在正相關，同時低流體剪切力也可以促進上皮間質轉化，并能進一步激活EGFR等轉錄調控因子[20]。但目前關于流體剪切應力與腫瘤關系的研究也鮮有報道，流體剪切應力導致肝癌發(fā)生發(fā)展的研究尚未見報道，而我們通過KEGG也富集出該通路，因此可做深入研究。研究報道AGE-RAGE通過激活PI3K/Akt通路調控RB的表達，進而促進前列腺癌細胞的增殖[21]。但目前關于該通路對肝癌影響的研究尚未見報道，因此值得進一步深入研究。謝如欣[22]研究表明多糖能通過影響PI3K/Akt、MAPK等信號通路發(fā)揮抑制抗腫瘤作用，但目前關于此研究較少?？鄥⒆饔冒悬c富集分析顯示能夠作用于肺、前列腺、膀胱等器官，通過上調或者下調疾病進展的相關基因來促進或者抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。

綜上所述，通過網絡藥理學這種研究方法，通過構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，對苦參多成分、多靶點、多通路進行分析，發(fā)現苦參抗肝癌的主要活性成分包括槲皮素（Quercetin），Glyceollin，芒柄花素（Formononetin），8-Isopentenyl-kaempferol和（2S）-7-hydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）-5-methoxy-8-（3-methylbut-2-enyl）chroman-4-one。上述活性成分通過抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

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（2020-03-05收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：CSCO中醫(yī)藥腫瘤研究基金項目（Y-L2018-002）

作者簡介：張元元（1992.04—），女，碩士研究生在讀，研究方向：消化道腫瘤的臨床診治與基礎研究，E-mail：1217192963@qq.com

通信作者：廖子君（1963.05—），男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤內科臨床診治與基礎研究，E-mail：liaozijun66@sina.com