魏雅婷，崔 燕，張 倩，何俊峰

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

肺離子細(xì)胞[1-2](pulmonary ionocyte)是2018年在人和小鼠肺中發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞，在肺纖維化的形成機(jī)制和修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)ATP6V0D2具有獨(dú)有的免疫反應(yīng)性[2]。牦牛雖長(zhǎng)期處于高原低氧環(huán)境下，但其肺卻無(wú)低氧造成的肺纖維化現(xiàn)象[3-4]。現(xiàn)有的肺離子細(xì)胞的相關(guān)研究?jī)H限于人和小鼠，尚無(wú)其他動(dòng)物的研究報(bào)道，也無(wú)ATP6V0D2在低氧環(huán)境中生活動(dòng)物的研究報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)、qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)ATP6V0D2在不同年齡牦牛肺中的分布和表達(dá)，確定ATP6V0D2在牦牛肺中的動(dòng)態(tài)分布和表達(dá)情況、探討ATP6V0D2在高原低氧適應(yīng)動(dòng)物肺結(jié)構(gòu)形成和功能保持方面的可能作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康牦牛肺采自甘南藏族自治州(初生1～7日齡)、青海省西寧市馬家肴屠宰場(chǎng)(幼年1～2歲和老年 7～10歲)、甘肅省臨夏自治州 (成年3～6歲)，每年齡段各3頭。頸動(dòng)脈放血處死，迅速采集肺組織固定于4%多聚甲醛溶液和液氮中。

1.2 免疫組織化學(xué)

石蠟切片4 μm，按SP試劑盒(北京博奧森生物科技有限公司)說(shuō)明書處理。ATP6V0D2抗體(Rabbit Anti-ATP6V0D2，bs-12548R，同上)1∶300稀釋，空白對(duì)照用0.01 mol·L﹣1的PBS代替一抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。深棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，淺棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，接近背景色或無(wú)色為陰性。Olympus DP71顯微照相系統(tǒng)進(jìn)行拍攝。

1.3 Western blot

稱0.1 g各年齡組牦牛肺組織，加入1 mL RIPA裂解液和10 μL PMSF，搖床冰浴2.5 h， 4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，吸上清，-20 ℃保存。將提好的蛋白按比例配制，金屬浴變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。一抗 (Mouse Anti-ATP6V0D2，ab236375，abcam；Anti-β-actin Mouse，N21123，北京全式金生物技術(shù)有限公司)，二抗1∶5 000[Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，N21009，同上]。Image J軟件分析目的條帶，根據(jù)所測(cè)灰度值計(jì)算出蛋白相對(duì)表達(dá)量，SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

1.4 qRT-PCR

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索牦牛β-actin(NM 173979.3)、ATP6V0D2 (NM 001046101.1)序列，Primer 6軟件設(shè)計(jì)引物。目的片段197 bp，引物序列：F: 5′-ACCCCTAGCTCCGTTCTTTC-3′；R: 5′-TGATGATAAAAGCACGCCGG-3′，內(nèi)參片段141 bp，引物序列：F: 5′- GCAATGAGCGGTTCC-3′；R: 5′-CCGTGTTGGCGTAGAG-3′。按照TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))總RNA提取試劑盒提取4個(gè)年齡組牦牛肺組織的總RNA，Promega試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用Lightcycler96(Roche，美國(guó))進(jìn)行qPCR。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

ATP6V0D2主要分布于肺內(nèi)支氣管及其分支管壁上皮黏膜層的纖毛細(xì)胞和克拉拉細(xì)胞內(nèi)(圖1)。在各年齡組均呈陽(yáng)性表達(dá)，以成年組和老年組表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。

a、b.初生組；c、d.幼年組；e、f.成年組；g、h.老年組；i～l.各年齡空白對(duì)照。SB.小支氣管；B.細(xì)支氣管；TB.終末細(xì)支氣管

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)

ATP6V0D2在初生組表達(dá)量最高，與其他各組比較，差異性均顯著(P<0.05)；幼年組表達(dá)次之，和其他各組比較，差異性均顯著(P<0.05)；成年組和老年組之間表達(dá)差異性不顯著(P>0.05)(圖2)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同

2.3 Western blot 檢測(cè)

ATP6V0D2在不同年齡組牦牛肺中均能檢測(cè)到不同程度的表達(dá)(圖3)。成年組表達(dá)量顯著高于其他3組(P<0.05)，其他3組兩兩比較，差異性均顯著(P<0.05)(圖3 B)。

A.ATP6V0D2免疫印跡蛋白條帶; B. ATP6V0D2灰度值分析

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ATP6V0D2在牦牛肺中普遍分布于肺內(nèi)支氣管分支的上皮細(xì)胞中，并沒(méi)有特定的僅表達(dá)于某一種細(xì)胞中，這與Plasschaert等[1]僅在肺離子細(xì)胞中表達(dá)結(jié)論相悖。但也有研究證明，ATP6V0D2會(huì)在培養(yǎng)的肺II型細(xì)胞[5]、破骨細(xì)胞[6]和一些癌細(xì)胞[7]中的某個(gè)階段表達(dá)。Nishi等[8]從小鼠(D2)中分離出編碼亞型D的cDNA，在肺、心和脾中也檢測(cè)到表達(dá)。ATP6V0D2在牦牛肺內(nèi)細(xì)支氣管及其分支上皮黏膜層的纖毛細(xì)胞和克拉拉細(xì)胞中均有不同程度的分布，可能具有類似肺離子細(xì)胞的部分功能，與肺離子細(xì)胞可能具有相關(guān)性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ATP6V0D2在各年齡組牦牛肺支氣管分支上皮中均有分布，但表達(dá)量有所不同，其蛋白以成年組表達(dá)量最高。這可能與牦牛肺對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程和適應(yīng)能力相關(guān)：初生到幼年階段牦牛肺尚未完全發(fā)育，生理機(jī)能尚不健全，處于對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中；成年時(shí)肺上皮細(xì)胞增生、細(xì)胞代謝能力和抗損傷等能力達(dá)到頂峰， ATP6V0D2的表達(dá)在成年組中達(dá)到最大值；之后隨著年齡增長(zhǎng)，生理機(jī)能下降，ATP6V0D2的表達(dá)也開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。ATP6V0D2可能在牦牛肺適應(yīng)高原低氧環(huán)境、防止氣道損傷或修復(fù)方面發(fā)揮重要作用，其作用機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

ATP6V0D2在不同年齡牦牛肺內(nèi)支氣管分支管壁的上皮細(xì)胞內(nèi)均有不同程度分布和表達(dá)，以成年組表達(dá)最高，主要分布于黏膜層的纖毛細(xì)胞和克拉拉細(xì)胞。牦牛氣道纖毛細(xì)胞和克拉拉細(xì)胞與肺離子細(xì)胞可能具有功能上的相關(guān)性。ATP6V0D2在牦牛肺適應(yīng)高原低氧環(huán)境、防止肺損傷和肺纖維化、肺修復(fù)方面可能發(fā)揮重要作用。