焦智慧，張千振，王 月，劉 濤，劉博洋，馬亞軍，劉笑凝，樸晨曦，王洪斌*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是缺氧器官在恢復(fù)供氧后組織細(xì)胞損傷加重的現(xiàn)象[1]，在復(fù)雜的肝手術(shù)中，不可避免地會(huì)出現(xiàn)肝缺血再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury, HIRI)，它是導(dǎo)致術(shù)后并發(fā)癥和肝功能障礙的關(guān)鍵因素[2]，而氧化應(yīng)激是IRI早期重要的病理生理過(guò)程[3]。肝組織缺血缺氧期間會(huì)消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能遭到嚴(yán)重破壞，腺苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)生成主要由厭氧糖酵解制造。細(xì)胞內(nèi)的黃嘌呤二加氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶，這將導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，此外，肝中細(xì)胞色素P450氧化酶也能產(chǎn)生大量ROS，ROS蓄積會(huì)影響細(xì)胞的功能，直接損傷細(xì)胞核酸、蛋白、脂質(zhì)和碳水化合物代謝[4]，嚴(yán)重將導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。因此，有效減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)是緩解缺血再灌注損傷的重要方法。

脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)越來(lái)越被認(rèn)為是細(xì)胞治療和組織工程的一種有前景的種子細(xì)胞[6]。最近，研究表明，干細(xì)胞通過(guò)釋放可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行的旁分泌機(jī)制可能是細(xì)胞移植后組織修復(fù)和功能改善的關(guān)鍵[7]，一些研究甚至證明，直接注射干細(xì)胞分泌的因子可以起到優(yōu)于移植細(xì)胞本身帶來(lái)的治療效果[8]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(adipose-derived mesenchymal stem cells-conditioned medium, ADSCs-CM)來(lái)源豐富，取材簡(jiǎn)單，且易儲(chǔ)存，起效快，在心肌梗死[9]、創(chuàng)面愈合[10]、治療骨關(guān)節(jié)炎[11]、調(diào)節(jié)葡萄糖水平[12]等方面具有明顯的療效。腹腔鏡手術(shù)具有創(chuàng)口小、術(shù)后恢復(fù)快等優(yōu)勢(shì)，廣泛用于動(dòng)物模型的建立[13-16]。目前，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)氧化應(yīng)激損傷的研究多限于嚙齒動(dòng)物試驗(yàn)以及體外細(xì)胞模型試驗(yàn)，而干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除的氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，因此，本試驗(yàn)通過(guò)腹腔鏡手術(shù)建立小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除肝損傷模型，觀察肝損傷后移植ADSCs-CM和ADSCs對(duì)肝功能和氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探討ADSCs-CM和ADSCs對(duì)小型豬肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。為肝缺血再灌注氧化應(yīng)激的治療尋找新的無(wú)細(xì)胞療法，具有較強(qiáng)的臨床研究?jī)r(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

廣西巴馬小型豬24頭(20～30 kg)，4～6月齡，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查健康后進(jìn)行試驗(yàn)，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)管理?xiàng)l件保持一致。

1.2 儀器設(shè)備與試驗(yàn)試劑

高清醫(yī)用內(nèi)窺鏡攝像系統(tǒng)、醫(yī)用內(nèi)窺鏡冷光源(深圳市神州醫(yī)療設(shè)備有限公司)，全自動(dòng)氣腹機(jī)、腹腔鏡手術(shù)器械(日本Olympus公司)，獸用便攜式多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)(美國(guó)SurgiVet公司)，EPOCH連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BIOTEK基因有限公司)，組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司)。

硫酸阿托品注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司)，痛立定托芬那酸注射液(巍隆貿(mào)易有限公司)，丙泊酚乳狀注射液(西安力邦制藥有限公司)，異氟烷(河北一品制藥有限公司生產(chǎn))，DMEM低糖培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen生命技術(shù)有限公司)，胎牛血清(美國(guó)CLARK公司)，總膽紅素、乳酸脫氫酶、總蛋白、丙二醛、髓內(nèi)過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程有限公司，干細(xì)胞成脂、成骨、成肝誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基均購(gòu)于美國(guó)賽業(yè)生物科技公司，CD29、CD34、CD44、CD90抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.3 小型豬脂肪干細(xì)胞的鑒定及培養(yǎng)基的制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)健康的小型豬。麻醉后于無(wú)菌條件下取腹部脂肪，使用Ⅰ型膠原酶消化、終止、離心后，用200目銅網(wǎng)過(guò)濾，收集濾過(guò)后的細(xì)胞懸液用離心(1 500 r·min-1，10 min)，棄去上清，使用紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，再次離心(1 500 r·min-1，5 min)， 棄去上清，用完全培養(yǎng)基(10% FBS，1%青鏈霉素和1%谷氨酰胺)重懸細(xì)胞并接種在25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱(37 ℃，50 mL·L-1CO2)中培養(yǎng)。待細(xì)胞80%融合傳代接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

使用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基將P4代ADSCs向成脂、成骨和成肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)結(jié)束后，成脂細(xì)胞用油紅O對(duì)脂質(zhì)液滴染色鑒定，成骨細(xì)胞用茜素紅對(duì)礦化的鈣基質(zhì)染色鑒定，成肝細(xì)胞用PAS染液對(duì)糖原染色鑒定。此外，將ADSCs與抗豬FITC-CD29、FITC-CD34、FITC-CD44和FITC-CD90孵育，用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原。

本試驗(yàn)中使用P4代細(xì)胞制備干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合80%左右，用PBS輕柔洗去殘留的培養(yǎng)液，換用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)。48 h后，收集細(xì)胞上清離心(1 500 r·min-1，10 min)，去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片。無(wú)菌濾器過(guò)濾，收集濾液于3 KD超濾濃縮管中，5 000 g·min-1，濃縮25倍后，分裝，儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物分組及手術(shù)模型的建立

將24頭廣西巴馬小型豬隨機(jī)分為4組，每組6頭，分別為模型組(IRI組)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)照組(DMEM組)、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基組(CM組)以及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組(ADSCs組)。各組均通過(guò)腹腔鏡手術(shù)建立小型豬肝缺血再灌注合并部分肝切除模型。

小型豬稱(chēng)重后，肌內(nèi)注射硫酸阿托品(0.05 mg· kg-1)， 15 min后耳緣靜脈注射小型豬復(fù)合麻醉劑(0.02 mg· kg-1)，然后耳緣靜脈緩慢注射丙泊酚進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，氣管插管完成后立即連接呼吸麻醉機(jī)，麻醉過(guò)程中，異氟烷濃度維持在2.5%～4.0%，氧流量0.8～1.0 L·min-1，呼吸頻率15～20 次·min-1，潮氣量10～15 mL·kg-1，呼吸比1∶2，術(shù)中通過(guò)靜脈通路注射生理鹽水。待麻醉穩(wěn)定后建立腹腔鏡手術(shù)通路，手術(shù)采用四套管法，10 mm 內(nèi)徑套管為腹腔鏡鏡頭進(jìn)出通路，5 mm 內(nèi)徑套管皆為腹腔鏡手術(shù)器械的進(jìn)出通路。腹腔鏡視野下，充分分離肝實(shí)質(zhì)與膽囊管和膽囊動(dòng)脈，使用自制帶針止血帶阻斷右半肝入肝血流，缺血60 min后，用帶線雙針將肝實(shí)質(zhì)貫穿縫合結(jié)扎3排，每排3～4針。然后使用高頻電刀沿著預(yù)切線離斷肝左葉，如遇大血管用超聲刀閉合離斷，然后用電凝球和明膠海綿對(duì)肝斷面進(jìn)行止血，最后用預(yù)溫的生理鹽水沖洗肝斷面，確保斷面再無(wú)出血。

左半肝切除后，對(duì)不同分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射不同的物質(zhì)(圖1)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞組(ADSCs組)按照按每千克體重注射1×106個(gè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基組(CM組)注射與ADSCs組等量細(xì)胞分泌的培養(yǎng)基的濃縮液，基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)照組(DMEM組)注射與CM組等體積濃縮的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，模型組(IRI組)注射與DMEM組等體積的生理鹽水，注射方法選擇肝實(shí)質(zhì)內(nèi)注射。

圖1 試驗(yàn)分組示意圖

1.5 樣本采集與指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 樣本采集 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)前、術(shù)后1、3、7 d通過(guò)前腔靜脈采集血液樣本，用于肝功能的檢測(cè)；組織標(biāo)本通過(guò)腹腔鏡手術(shù)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前、術(shù)后1、3、7 d進(jìn)行肝組織的采樣，取出的肝組織液氮罐中迅速冷凍，保存于-80 ℃冰箱，待檢測(cè)使用。

1.5.2 肝功能的檢測(cè) 取各組術(shù)前，術(shù)后1、3、7 d的血清樣本，按照肝功能檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總膽紅素(T-BIL)、乳酸脫氫酶(LDH)、總蛋白(TP)指標(biāo)的變化。

1.5.3 氧化應(yīng)激反應(yīng)的檢測(cè) 取各組術(shù)前、術(shù)后1、3、7 d凍存于-80 ℃的組織樣本，根據(jù)丙二醛(MDA)試劑盒、髓內(nèi)過(guò)氧化物酶(MPO)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、過(guò)氧化氫酶(CAT)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，使用EPOCH連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)檢測(cè)各組相應(yīng)指標(biāo)的變化。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 腹腔鏡建立肝損傷模型安全性監(jiān)測(cè)

本試驗(yàn)通過(guò)腹腔鏡技術(shù)完成了小型豬肝缺血再灌注合并部分切除的肝損傷模型。術(shù)中、術(shù)后均未出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥。手術(shù)安全性監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)術(shù)前、術(shù)后1、3、7 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的心率(HR)、體溫(BT)、呼吸(RR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、平均動(dòng)脈壓(MAP)進(jìn)行檢測(cè)，4組之間的心率(HR)、體溫(BT)、呼吸(RR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MAP)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異。

表1 生理指標(biāo)監(jiān)測(cè)結(jié)果

2.2 小型豬脂肪干細(xì)胞的鑒定

體外分離培養(yǎng)的小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，旋渦狀生長(zhǎng)，如圖2A瑞氏染色所示。ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色發(fā)生顯色反應(yīng)，如圖2 B所示。成脂誘導(dǎo)兩周后，油紅O染色，如圖2C所示。成肝誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行PAS染色，見(jiàn)圖2D所示。取P4代小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面特異性抗原的陽(yáng)性率，結(jié)果如圖2 E～H所示，顯示豬ADSCs不表達(dá)CD34，陽(yáng)性率為1.0%，表達(dá)CD29、CD44、CD90，陽(yáng)性率分別為99.8%、99.5%、98.2%。

圖2 小型豬脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

2.3 肝功能檢測(cè)

肝功結(jié)果如圖3顯示：4組血清LDH水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，見(jiàn)圖3A，CM組與IRI組相比，術(shù)后1和3 d血清LDH水平極顯著降低(P<0.01)； ADSCs組與IRI相比，術(shù)后1和3 d血清LDH水平極顯著降低(P<0.01)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1和3 d差異極顯著(P<0.01)。TBIL水平均同樣呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，見(jiàn)圖3B，CM組與IRI組相比，術(shù)后1和3 d血清TBIL水平極顯著降低(P<0.01)；ADSCs組與IRI相比，術(shù)后1和3 d血清TBIL水平極顯著降低(P<0.01)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1和3 d差異極顯著(P<0.01)。4組血清中TP水平均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，見(jiàn)圖3C，CM組與IRI組相比，術(shù)后1和3 d血清TP水平極顯著升高(P<0.01)；ADSCs組與IRI相比，術(shù)后1 d血清TP水平極顯著升高(P<0.01)，3 d顯著升高(0.010.05)。即CM組與ADSCs組可以降低LDH和TBIL的升高程度，提高TP的表達(dá)水平，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)。

*.0.01

2.4 氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè)

4組肝組織MDA水平均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4A，CM組與IRI組相比，術(shù)后1和3 d肝組織MDA水平極顯著降低(P<0.01)；ADSCs組與IRI相比，術(shù)后1和3 d肝組織MDA水平極顯著降低(P<0.01)；DMEM組與IRI組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1 d差異極顯著(P<0.01),3 d差異顯著(0.010.05)。

圖4B顯示，4組肝組織SOD水平，均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，CM組與IRI組相比，肝組織SOD水平術(shù)后1 d極顯著升高(P<0.01)、術(shù)后3 d顯著升高(0.010.05)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1 d 差異極顯著(P<0.01)，術(shù)后3 d差異顯著(0.010.05)。

圖4C顯示，4組肝組織CAT水平，均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，CM組與IRI組相比，肝組織CAT水平術(shù)后1 d極顯著升高(P<0.01)；術(shù)后3 d差異顯著(0.010.05)；DMEM組與IRI組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1 d差異顯著(0.010.05)。

圖4D顯示，4組肝組織GSH-Px水平，均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，CM組與IRI組相比，肝組織GSH-Px水平術(shù)后1 d極顯著升高(P<0.01)；術(shù)后3 d無(wú)明顯差異(P>0.05)；ADSCs組與IRI相比，術(shù)后1 d肝組織GSH-Px水平顯著升高(0.010.05)；DMEM組與IRI組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1 d差異極顯著(P<0.01)；而CM組與ADSCs組兩組之間在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖4E顯示，4組肝組織MPO水平，均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，CM組與IRI組相比，肝組織MPO水平術(shù)后1 d極顯著降低(P<0.01)，術(shù)后3 d無(wú)明顯差異(P>0.05)；ADSCs組與IRI相比，術(shù)后1 d肝組織MPO水平極顯著降低(P<0.01)，術(shù)后3 d無(wú)明顯差異(P>0.05)；DMEM組與IRI組相比，各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；CM組與DMEM組相比，術(shù)后1 d差異極顯著(P<0.01)；而CM組與ADSCs組兩組之間在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

圖4 氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞由于低免疫原性及多向分化的潛能，成為再生醫(yī)學(xué)中一種廣泛的細(xì)胞來(lái)源。一直以來(lái)，人們普遍認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞治療效果的作用機(jī)制是分化作用。最近的研究表明，干細(xì)胞通過(guò)釋放可溶性細(xì)胞因子進(jìn)行的旁分泌機(jī)制可能是干細(xì)胞移植后組織修復(fù)和功能改善的關(guān)鍵機(jī)制。干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM)是指細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的生物活性因子，包括可溶性蛋白質(zhì)、游離核酸、脂質(zhì)體、凋亡小體、微粒子和外泌體等[17]。直接移植干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基具有許多優(yōu)點(diǎn)，首先避免了細(xì)胞移植后存活率低的問(wèn)題，有數(shù)據(jù)表明只有不到3%的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在移植后持續(xù)存活2周[18-19]；其次移植干細(xì)胞仍然存在免疫排斥反應(yīng)[20]；同時(shí)還存在惡性轉(zhuǎn)化的可能[21]。因此，脂肪來(lái)源干細(xì)胞培養(yǎng)基作為潛在的無(wú)細(xì)胞療法，目前在治療各種疾病的研究以及應(yīng)用也逐漸開(kāi)展。

氧化應(yīng)激損傷是肝缺血再灌注常見(jiàn)的病理過(guò)程，肝缺血再灌注和部分切除為ROS的產(chǎn)生創(chuàng)造了必要條件，ROS可以通過(guò)干擾碳水化合物、核酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的各種新陳代謝來(lái)改變或惡化細(xì)胞；同時(shí)，缺血期使線粒體的功能受損，細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)功能失調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的氧還原形成氧自由基，致使短時(shí)間內(nèi)ROS大量聚集引起生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)造成細(xì)胞死亡。目前已有體外細(xì)胞模型的研究，證實(shí)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[22-24]，但尚缺乏干細(xì)胞條件培養(yǎng)基在大動(dòng)物在體試驗(yàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)的相關(guān)研究。

肝缺血再灌注及肝部分切除會(huì)對(duì)肝實(shí)質(zhì)造成不同程度的損傷，剩下健康的肝組織也會(huì)由于缺血再灌注發(fā)生病理?yè)p傷。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)肝功能的檢測(cè)探究ADSCs-CM和ADSCs對(duì)肝損傷后肝功能的影響。LDH是催化乳酸氧化為丙酮酸的一種糖酵解酶，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)，LDH的含量升高；當(dāng)肝細(xì)胞壞死時(shí)，TBIL含量上升；TP可以分為白蛋白和球蛋白，在機(jī)體生理中具有維持血液滲透壓、運(yùn)輸代謝物質(zhì)以及營(yíng)養(yǎng)作用的生理功能，但在肝細(xì)胞發(fā)生損傷，肝功能受阻時(shí)，蛋白合成發(fā)生障礙，會(huì)導(dǎo)致血清TP的降低。因此，LDH、TBIL、TP是判斷肝功能的重要指標(biāo)。有研究表明，單獨(dú)移植豬的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效改善肝缺血再灌注后的肝功能[25]。而在本試驗(yàn)中，可以觀察到CM組、ADSCs組在術(shù)后1和3 d均能降低IRI組LDH、TBIL的表達(dá)水平，提高TP的表達(dá)水平，說(shuō)明ADSCs-CM與ADSCs均有明顯的治療效果，因?yàn)镃M組與DMEM組呈顯著性差異，DMEM組與IRI組無(wú)顯著性差異，表明DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)肝功能的恢復(fù)無(wú)治療作用，而CM組起治療作用的是溶于培養(yǎng)基中ADSCs分泌的有效生物成分，即ADSCs-CM能夠改善肝功能，加快術(shù)后肝功能的恢復(fù)，對(duì)小型豬肝缺血再灌注與肝切除損傷起保護(hù)作用。

ROS是一種生物體內(nèi)作為細(xì)胞代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生的含氧化學(xué)物質(zhì)，ROS的大量聚集引起生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，機(jī)體氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物MDA會(huì)隨氧化反應(yīng)程度而升高，因此MDA可以用來(lái)衡量細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，判斷氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度；而MPO是發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞分泌的酶，當(dāng)MPO從細(xì)胞釋放后，可以通過(guò)催化氧化氯離子產(chǎn)生次氯酸，破壞多種靶物質(zhì)，MPO還能催化生成大量的氧化劑，當(dāng)氧化劑與抗氧化劑的平衡被破壞后，過(guò)量的氧化劑又會(huì)加重組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。但在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，抗氧化酶系的SOD、CAT、GSH-Px能夠催化超氧陰離子自由基生成氧和過(guò)氧化氫，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化的平衡起至關(guān)重要的作用，抗氧化物酶SOD、CAT可以清除自由基的產(chǎn)生，GSH-Px可以直接和自由基反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞膜。在肝缺血再灌注的過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)中，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA以及引起釋放MPO的水平持續(xù)增加，而抗氧化應(yīng)激的SOD、CAT、GSH-Px酶活力減弱，提示可以通過(guò)增強(qiáng)抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-Px活性，減少M(fèi)DA以及MPO含量，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物，增強(qiáng)肝抗氧化應(yīng)激能力，繼而緩解HIRI后的肝細(xì)胞損傷。

本研究建立小型豬的肝缺血再灌注合并部分切除模型，通過(guò)對(duì)肝組織的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CM組和ADSCs組在術(shù)后顯著提高了抗氧化酶的活性，降低了氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA與MPO的表達(dá)水平，減少了氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞的損傷。國(guó)內(nèi)有研究將人的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植用來(lái)修復(fù)肝缺血的再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)可以顯著降低肝組織MDA的濃度[26]，移植豬的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞也可減緩肝缺血再灌注后的氧化應(yīng)激反應(yīng)[27]，還有學(xué)者在體外構(gòu)建神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型，通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基干預(yù)，證明了神經(jīng)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠一定程度上減輕小鼠皮層神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷[28]。相似的是，國(guó)外一些研究證實(shí)了干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的抗氧化能力，研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以通過(guò)減少ROS來(lái)提高氧化應(yīng)激條件下神經(jīng)元的存活數(shù)量[29]。體外試驗(yàn)用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，MSC-CM可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕過(guò)氧化氫引起肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[30]；Hong等[31]使用人的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基和本試驗(yàn)同樣采用3 KD濃縮25倍，構(gòu)建小鼠70%肝切除模型，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理能顯著增加肝中SOD、GSH-Px、過(guò)氧化氫酶等3種抗氧化蛋白的表達(dá)，并通過(guò)增加抗氧化酶的表達(dá)來(lái)提供對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，小型豬ADSCs-CM能夠提高肝缺血再灌注合并部分切除術(shù)后的抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-Px活性，減少M(fèi)DA以及MPO的表達(dá)，提示ADSCs-CM可以提高抗氧化酶的活性，從而減輕肝氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷。

4 結(jié) 論

通過(guò)移植ADSCs和ADSCs-CM對(duì)小型豬肝缺血再灌注合并部分肝切除損傷中肝功能和氧化應(yīng)激影響的研究，發(fā)現(xiàn)ADSCs和ADSCs-CM均能夠減輕缺血再灌注導(dǎo)致的肝損傷，減緩氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明ADSCs-CM作為無(wú)細(xì)胞療法可減輕肝缺血再灌注后的氧化應(yīng)激損傷，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)替代細(xì)胞治療的弊端，并具有一定的臨床應(yīng)用和轉(zhuǎn)化價(jià)值。